Martin J. Cohn, juan Carlos Izpisùa-Belmonte, helen Abud, John K

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1 Fibroblaste Growth factors induce Additional limb developpement from the Flank of Chick Embryos.
Martin J. Cohn, juan Carlos Izpisùa-Belmonte, helen Abud, John K. Heath, and Cheryll Tickle.

2 Introduction Chez la plupart des vertébrés, deux paires de bourgeons de membre se forment à partir de la plaque latérale du mésoderme, à un niveau axial particulier et se développent pour donner les membres. Se sont des interactions cellulaires à l’intérieur même du bourgeon qui conduisent à la morphogenèse des membres. La crête apicale ectodermique (AER) maintient la croissance proximodistale en gardant les cellules de l’extrémité du bourgeon, dans un état de prolifération continue, mais en stade indifférencié.

3 Le signal AER peut être substitué par l’application d’un facteur de croissance de fibroblaste (FGF).
Dans la marge postérieure du bourgeon, il existe une région polarisée. Le développement du membre est dû à l’implication de cette région avec les FGF. Shh, responsable de cette activité polarisante est capable d’induire la duplication de doigts (le long de l’axe antéropostérieur du membre). Il est aussi l’activateur de certains gènes Hox nécessaires à la formation des membres.

4 L’injection de FGF induit le développement de membre(s) supplémentaire(s):
Des billes FGF1, FGF 2 et FGF 4 injectées dans le flanc d’un embryon de poulet donnent un ou plusieurs membre(s) supplémentaire(s). (Figure 1) -Stade 13: Bien avant que les 1er signes de bourgeon apparaissent. -Stade 17: Épaississement de la plaque latérale du mésoderme où se formera le bourgeon. Le flanc apparaît entre les somites 21 et 25.

5 Expérience : On injecte des billes FGF 2 à différents niveaux du corps dans le mésoderme entre les stades 13 et 17. -Injection entre les somites 20-26: Membres supplémentaires, ailes et pattes complètes apparaissent sur le flanc.

6 Si on injecte les billes proche du cou ou de la queue, on n’a pas formation de membre supplémentaire. Le potentiel pour avoir un membre supplémentaire se développant sur le flanc semble être maximale à partir du stade 13. Les embryons traités des stades 10 à 12, ne présentent pas de membres supplémentaires, mais les ailes et pattes peuvent se déplacer le long du corps et quelques fois il y a des malformations. La capacité à produire un membre supplémentaire dure jusqu’au stade 17.

7 Tableau 1:

8 Patron d’expression du membre supplémentaire:
Ils sont en général complets. Quelques fois développement retardé. Quelques fois l’aile normale est tronquée. Quelques fois l’aile supplémentaire manque de structure(s) distale(s).

9 Figure 4:

10 La nature des membres supplémentaires est relative à la position d’injection des billes.
-Quand les billes sont injectées dans la partie antérieure du flanc (somites 21-22): Les membres supplémentaires sont des ailes. -Quand les billes sont injectées au milieu du flanc (somites 23): Les membres supplémentaires sont des ailes, des pattes ou des chimères. -Quand les billes sont injectées dans la partie postérieure du flanc (somite 24): Les membres supplémentaires sont des ailes et des pattes. -Quand les billes sont injectées encore plus postérieurement (somite 25): Seules des pattes peuvent se former.

11 Si les billes sont injectées à l’endroit où les ailes et les pattes normales se forment:
Nous obtenons un membre chimérique prés du membre normal, présentant les éléments proximaux de la patte, et les doigts des ailes.

12 Nous constatons ensuite qu’un seul des membres supplémentaires avec doigts, a une polarité antéropostérieure normale. Dans tous les autres cas, l’axe antéropostérieur est inversé. La plupart des membres développant des doigts d’ailes après implantation de billes FGF2 du côté antérieur ou au milieu de flanc (somites 20-23) possèdent un doigt n°3 supplémentaire.

13 Les membres à polarité inversée résultant de l’injection de billes FGF2 dans le flanc postérieur n’ont jamais de doigts supplémentaires. Un membre supplémentaire peut fusionner avec l’aile normale. On obtient un membre inversé, où les doigts postérieurs se retrouvent au milieu.

14 Quelques fois l’os de l’avant bras est fusionné à l’intersection des deux membres en un seul large élément, et les doigts postérieurs ne se forment pas.

15 Mais ceci ne peut pas s’assimiler à une fusion.
En plus de causer l’apparition de membre supplémentaire, FGF peut déplacer l’aile postérieurement, le long de l’axe du corps. Mais il peut aussi induire le développement d’une seule grande excroissance le long du tronc, qui contient les éléments squelettiques de l’aile et de la patte. Mais ceci ne peut pas s’assimiler à une fusion.

16 Développement précoce du membre supplémentaire.
Figure 3: Insertion de billes FGF2 dans le flanc de l’embryon et observation du développement des membres: On observe la formation d’un bourgeon de membre supplémentaire entre le bourgeon de l’aile et celui de la patte. Mais celui-ci est légèrement atrophié par rapport au bourgeons de membres normaux. On note que le bourgeon supplémentaire présente une région AER bien développée.

17 Tableau 2: Implantation de billes FGF2, puis extraction de celles-ci à différents temps. Et observation de l’effet sur le développement des membres. Résultat: L’extraction des billes après 2 heures, n’interfère pas avec la croissance et le développement des membres supplémentaires.

18 Les bourgeons de membres supplémentaires expriment Shh et Hoxd-13
Figure 2: Nous observons que l’expression de ces deux gènes n’apparaît qu’entre 25 et 48 heures après l’implantation de billes FGF2 dans le bourgeon supplémentaire. De plus, on note que l’expression de ces deux gènes est réduite à la zone antérieure du bourgeon supplémentaire, ce qui est inversé en comparaison au bourgeon normal, dans lequel ils sont localisés postérieurement.

19 Discussion Comment une source locale de FGF pourrait initier la formation d’un bourgeon de membre ? Figure 5:

20 L’application de FGF sur le flanc induit la formation de membre dans une région où les membres ne se forment pas habituellement ; ce qui suggère que l’apparition du bourgeon de membre normal nécessite une source locale de FGF. 1) production locale de FGF au niveau axial approprié, c’est à dire entre somites n et m. 2) le signal FGF maintient la prolifération des cellules du mésoderme de la plaque latérale, et active les gènes Shh dans les cellules à activité polarisantes potentielles ( région postérieure du bourgeon en formation ). Ce qui crée une région polarisée. ( mais Shh n’est pas activé directement par FGF…cf. table 2 )

21 3) Un signal de la région polarisée agit en synergie avec les FGFs pour établir une zone de progression et activer les gènes Hoxd. 4) Les cellules de la zone de progression émettent un signal qui conduit à la formation de la crête ectodermique apicale ( AER ). Ce qui conduit à l’établissement d’un bourgeon de membre. 5) La partie postérieure de la crête apicale produit FGF-4, qui maintient un état de prolifération continu des cellules de la région polarisée, et de celles du mésenchyme distal de la zone de progression ; qui à son tour maintient l’AER, et donc la morphologie du bourgeon.

22 Le membre additionnel se caractérise par une polarité inversée
Rappel : dans les bourgeons ectopiques, Shh et Hoxd-13 sont exprimés dans la région antérieure du bourgeon, l’inverse de la distribution trouvée dans les membres normaux ( postérieure ). Cette expression ectopique corrèle avec la morphologie inversée des doigts. Pour expliquer cette inversion la région de polarisation discrète, située en aval de la région postérieure de celle du bourgeon d’un membre normal; Création d’un gradient cette fois-ci antéro-postérieur, d’où un patron d’expression inversé car celui-ci s’oriente en respectant la polarité de la région antérieure.

23 Cependant, la formation du membre n’est pas normal
Cependant, la formation du membre n’est pas normal. En effet, la région exprimant Shh est réduite, ce qui peut s’expliquer par un plus faible gradient de polarisation en comparaison de celui de la région postérieure. De plus les membres ont constate l’apparition d’un doigts en double (le 3) si le membre supplémentaire est situé dans la partie antérieur ou au milieu du flanc.

24 Lequel des FGF initie le développement des membres dans un embryon normal?
Nous avons montré que trois FGF:1, 2 et 4 peuvent induire le développement d’un membre, mais aucun d’eux ne semblent être le signal qui déclenche la formation du bourgeon. le transcrit d’FGF4 n’est détecté que lorsque le bourgeon est formé. FGF2 est détecté dans le flanc, mais on n’observe pas de formation de membre. FGF8 est exprimé dans l’ectoderme quand le bourgeon commence à émerger: rôle potentiel dans les stades très précoces du bourgeon. Grâce à des expérience supplémentaires, nous supposons qu’une stimulation du mésenchyme est requise pour le developpement d’un membre supplémentaire.

25 Position et identité des membres:
Les résultats suggèrent qu’une production locale d’un FGF contrôle la position des membres, mais la nature du signal activant la production d’FGF, et la façon dont cette production est contrôlée sont toujours inconnues. La position à laquelle le signal est produit, peut être encodée par le patron d’expression du gène Hox le long de l’axe du corps. Ex: Souris, grenouille et poisson zèbre,les membres supplémentaires se développent au niveau correspondant à la limite antérieur d’expression de Hoxc8.

26 Une explication moléculaire pour l’induction d’un membre:
Tests sur membres d’amphibiens suggèrent que leur régénération peut être initiée en ajoutant des molécules semblables aux FGF sur le nerf traumatisé. Ainsi la production d’un FGF peut être la base moléculaire de la capacité à induire un membre.

27 CONCLUSION : L’application locale de FGF sur le flanc d’embryon de poulet établit un nouvel axe de croissance proximodistal qui initie le développement d’un bourgeon de membre. Et la nature et la morphologie de ce membre est conditionnée par une fenêtre de temps ( stades 13 à 17 ) et de position ( somites 21 à 25 ). Par ailleurs l’application de FGF dans le mésoderme initie très précocement le mécanisme de développement du membre.(soit active précocement Shh)

28 Mécanisme : FGF maintient d’abord un état de prolifération des cellules du mésenchyme, puis active les gènes de Shh dans les cellules polarisantes. Le bourgeon de membre acquiert alors une région polarisante, qui coopère avec FGF pour former une zone de progression. Il s’ensuit l’activation des gènes Hoxd, et l’induction d’une crête apicale. Bourgeon de membre L’AER sécrète FGF-4 qui exerce un rétrocontrôle positif sur la région polarisée. Ces membres supplémentaires ont une polarité inversée. Aucun des candidats FGF testés ici, ne semble être l’initiateur du bourgeon.