Dimitris Bourikas et toute son équipe.

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1 Dimitris Bourikas et toute son équipe.
Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de l’axe longitudinal du cordon spinal. Dimitris Bourikas et toute son équipe.

2 INTRODUCTION Durant le développement des circuits neuronaux les axones en croissance se dirigent vers des cellules cibles,en réponse a des signaux de guidage répulsifs et/ou attractifs. Un des modèles de guidage axonal très étudié est celui des axones commissuraux situés dans le tube neural.

3 Rappel sur le développement du système nerveux

4 A la partie la plus antérieur (rostrale) du Tube Neural, on a les vésicules céphaliques qui se forment. A la partie la plus postérieur (caudale) du Tube Neural, on a une segmentation des somites.

5 Dans TN, on a des progéniteurs pour différentes structures cellulaires.
Certains vont donner des neurones commissuraux. Leur axones entrent en contact étroit avec la surface de la pp, traversent la ligne médiane et tournent rostralement le long de l’axe longitudinal du cordon spinal.

6 Mise en évidence du guidage axonal par la technique de « Open–Book » :

7 BUT : Mettre en évidence des molécules intervenant dans le guidage des axones commissuraux

8 Model: Embryon de poulet Partie lombo-sacrale Stade du développement:

9 Découverte de Shh par hybridation soustractive :

10 Hybridation soustractive :
Stade Stade 26 ARNm de PP E F G A B C D ABCD Comparaison E F G Séquençage et lignage Bio Info ADNc SHH

11 Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux (1):
Perte de fonction de shh par RNAi in ovo: Pas de modification sur la croissance des axones. Wt +RNAi

12 Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux :
Absence d’orientation rostrale. Les axones restent au niveau des bordure de la PP et dans la plupart des cas ils tournent caudalement… …mais sembleraient rétablir leur trajectoire en formant des boucles (fig d)

13 La perte de fonction de SHH montre un blocage dans l’orientation rostrale des axones commissuraux.
Ceci a été confirmé par l’utilisation d’AC bloquant la fonction de SHH. SHH est donc nécessaire pour le l’orientation rostrale des axones commissuraux…des expériences complémentaires ont révélés une action directe de SHH.

14 Les récepteurs de Shh : Patched (Ptc) et Smoothened (Smo) = co-recepteur de Shh médiant ses activités inductibles. Pour savoir si Ptc et Smo sont associés aux effets de Shh sur les axones commissuraux, on analyse leur patron expression au stade Stade 23 Stade 24

15 Patron expression de Ax1,Smo,Ptc
Hybridation in situ Axonin-1(Ax1)=molécule d’adhésion exprimée par les axones commissuraux (AC). Pas d’expression de Smo et Ptc par AC. Ceci suggère qu’ils ne sont pas requis pour l’action de SHH. Autre expérience: utilisation de cyclopamine, inhibiteur de Smo ne modifie pas l’orientation rostrale

16 Les récepteurs de Shh :Hip
Proteine transmembranaire liant directement les proteines Hedgehog (Indian, Desert, Sonic) Patron expression de Hip au stade 23,24,26

17 Hip est exprimé par quelques neurones pendant un temps bref
Hybridation in situ Stade 23: pas d’expression de Hip. Stade 24 : expression de Hip. Stade 26 : peu d’expression de Hip. Conclusion : Hip est exprimé par quelques neurones pendant un temps bref Expression temporellement et transitoire

18 Perte de fonction de Hip: RNAi
Lors d’une perturbation des fonctions Hip: Phénotype identique à celui observé lors du RNAi de SHH. Hip est le récepteur médiant l’effet de Shh.

19 Hip et SHH permettent d’orienter les AC au niveau rostral du cordon spinal.
Questions : Pourquoi au niveau rostral et non caudal ? Quelle est la différence entre ces deux niveaux ?

20 Gradient de SHH le long de l’axe longitudinal du cordon spinal :
Hybridation in situ de shh au stade 25 Forte expression de SHH au niveau Caudal. Faible expression au niveau rostral. Gradient d’expression de SHH tout le long le l’axe longitudinal du cordon spinal. Ce gradient suggère un mécanisme de répulsion de SHH sur les AC

21 Expérience de gain de fonction de SHH :
Electroporation in ovo permettant d’exprimer Shh sélectivement : Thoracique Niveau supérieur lumbo-sacral Niveau caudal lumbo-sacral

22 Les AC ne quittent pas la PP en présence de concentration élevé de SHH.
Les AC se dirigent en évitant les concentration de SHH élevé soit caudalement soit rostralement.

23 Ce modèle d’étude permet de confirmer l’effet répulsif de SHH quand les neurones doivent tourner rostralement c’est-à-dire au moment oú ils expriment Hip à leur surface.

24 Confirmation de l’effet répulsif de SHH par un modèle in vitro :
Marquage des NC avec une molécule fluorescente Explant d’embryon de stade 24-25 Culture dans gel collagène Bille-SHH Bille-BSA

25 Effet répulsif de shh sur les AC du cordon spinal.
Résultat : Pas de prologement d’axone en direction de la bille-SHH Présence de prolongement d’axone en direction de la bille-BSA. Effet répulsif de shh sur les AC du cordon spinal.

26 Conclusion et Discussion :
Grâce au technique de RNAi in ovo, on a identifié le rôle de shh dans le guidage axonal. Au début de la formation du TN, Shh a un effet attractant et permet la croissance des AC vers la PP du cordon spinal. Ces effets sont permis par les co-récepteurs Smo et Ptc exprimés par les AC. Puis Shh dirige les AC le long de l’axe longitudinal du cordon spinal en direction rostral oú on trouve des régions pauvres en Shh. Cet effet répulsif est permis par l’expression de Hip par les AC.

27 Quelques mécanismes incompris :
Hip protéine membranaire de type I : Pas de domaine intracellulaire. La partie C(ter) est hydrophobe donc transmembranaire. Prb : Comment Hip transmet le signal pour la migration des AC au niveau rostral ? Réponse : Hip pourrait être un composant d’un récepteur complexe composé d’une unité liant SHH (Hip) et d’une unité transmettant le signal qui n’ pas été encore identifié.

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