Protéases Pr Eric Chabriere eric.chabriere@afmb.univ-mrs-.fr.

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1 Protéases Pr Eric Chabriere

2 Les protéases à cystéine
La papaine (EC )est une protéase issue de la papaye et du latex Enzyme de 24.4 kDa Structure a-b 3 pont disulfures 1pap

3 Le site actif est constitué d'un triade catalytique Cys 25, His 159, Asn 175
sillon N175 C25 H159 La sillon ou se trouve le site actif, ne présente pas de gorge de spécificité (comme la trysine). Par conséquent a papaine est une protéase à large spécificité avec une préférence pour les substrat avec un acide aminé volumineux et hydrophobe en I+2. Elle fragmente les protéines 1CVZ

4 Mécanisme La triade catalytique active la cystéine.
La cysteine attaque la liason peptidique. L'état de transition est stabilisé par l'azote de la chaine latérale de Gln L'histidine protonnée transfert son proton à l'azote de la chaine principale. Ce qui libère la partie C-term. On a la formation d'un intermédiaire thio enzyme L'histidine active une molécule d'eau qui attaque l'intermédiaire thio-enzyme. L'état de transition tétraédrique et négatif est stabilisé par Gln

5 Q19 La cystéine catalytique est sensible l'oxygène N175 H159 1pap La papaine sera activé par : les agent réducteur de type b-mercapto-éthanol Par l'EDTA qui évite que des cations inhibent la cysteine

6 Grâce à l'utilisation d'un cysteine à la place d'une serine la papaine est une protéase active en milieu acide. Grace à sa capacité de fragmenter les protéine, elle a de nombreux intérêt en biotechnologie et médecine: -Traitement de blessures, enlève les tissu nécrosés -Traitement de la peau, acné, verrue, cicatrice… -Séquençage de protéine -Séparation des Fab (anticorps) . -aide à la digestion. -attendrissement de la viande -anti venin

7 Autres protéases à cysteine
Caspase (E.C ) Elles jouent un rôle essentiel dans les phénomènes d’apoptose, de nécrose et d’inflammation. Coupe exclusivement après un acide aspartique Triade carbonyl (chaine principal), histidine, cysteine Sandwich triple a/b/a (rosman fold) Cavité de reconnaissance pour l'acide aspartique

8 Calpaine (EC ) Les calpaine sont de protéase calcium dépendante. Certaines sont impliquées dans la remodélisation du cytosquelette. On retrouve le motif structural de la papaine. Le calcium est fixé grâce à des motif EF-hand (calmoduline). Le site actif est composé d'une triade catalytique Cys, His, Asn 1MDW 1KFX On peut constater que sans la fixation des ions calcium le site actif est détruit.

9 cathepsine

10 Les protéases acides La pepsine (EC ) est une protéase de l'estomac (70 ka). Elle coupe de préférence entre 2 acides aminé hydrophobe et aromatique 2 domaines en tonneaux beta 2 ponts disulfures 1PSA Entre les 2 domaines, 2 acides aspartiques se font face

11 2 acides aspartiques cote à cote, c'est défavorable.
Il n'y a pas de charge positive pour compenser. Par conséquent, les pka de ces résidus ont changé. En particulier, un acide aspartique va augmenter son pka et se protonner. Pka 3.1 pKa 5.5 Un acide aspartique pourra jouer le rôle de base, l'autre le rôle d'acide

12 Mécanisme Etape 1 L'aspartate (base) active une molécule d'eau qui a attaquer la liaison peptidique. L'acide aspartique (acide) se déprotonne pour stabiliser l'etat intermédiaire asp asp asp asp Etape 2 (étape limitante) La liaison peptidique se brise. Le proton est transféré sur l'azote N-terminal. La structure SP2 est rétablie en transférant le proton vers l'autre aspartique. asp asp asp asp Dans ce mécanisme, il n'y a pas d'etat intermédiaire covalent. Effet du pH. Pour être actif un acide aspartique doit être protonnée. Par conséquent, il 'agit d'une protéase active à pH acide ( ) (estomac)

13 Le VIH Le VIH est un virus à ARN. L'ARN doit être transcrit en ADN pour exprimer les protéine du virus. Les protéine transcrites doivent être clivée par une protéase pour libérer les protéines fonctionnelle

14 La protéase du HIV La protease du VIH est un homodimere de 2X11 Kda. A l'interface, on y trouve le site actif constituée de 2 Asp. 1HPV

15 Inhibiteur de la protéase du HIV
Il existe de nombreux inhibiteurs qui viennent inhiber la protéase du HIV en bloquant le site actif

16 Les protéases à Zinc La thermolysine de Bacillus thermoproteolyticus
C'est une protéase de 34Kda. Elle est constitué de 2 domaines a-b type roll a bundle Elle contient 4 atome de calcium et 1 atome de Zn (site actif) 1kei preferential cleavage: -/-Leu > -/-Phe

17 Coordination des métaux
Exemple de coordination d'un calcium. coordination hexagonal 2 glu 1 asp 1 carboxyle (chaine principale) 2 molécule d'eau L'atome de Zn est tétraedriquement coordonné par 2 histidines et par un acide aspartique. Et certainement par un ion OH- (acide de Lewis)

18 Le site actif Le site actif est dans une crevasse très négative.
Il faut stabiliser l'ion Zn2+. Les autres cation (Ca) peuvent servir à la thermostabilité de l'enzyme (active à 70°) Le site actif est constitué d'une histidine d'un acide aspartique qui oriente et active l'histidine (diade catalytique) et d'un atome de Zn

19 L'histidine est rendu plus basique grâce à l'acide aspartique (protéase à serine). L'histidine active une molécule d'eau. La molécule d'eau attaque la liaison peptidique Le zinc stabilise l'etat intermédiaire SP3 et négatif (stabilisation de l'oxyanion). La partie C-term se dissocie et le proton de l'histidine est transféré vers l'azote de la liaison peptidique L'azote N-term est basique, le groupe carboxylique C-term est acide. Comme la réaction est rapide, il y a échange de protons entre ses deux groupes.

20 Effet du pH Inhibiteur L'enzyme à un pH optimum situé entre 5 et 7
L'ion hydroxyde qui coordonne le Zn2+ doit se protonner pour laisser la place au substrat. L'histidine doit être deptronnée Inhibiteur L'EDTA (Ethylenediaminetetraacetic) a la capacité de chélater les cation divalent. Par conséquent, il inhibe les protéase à Zn. On utilise l'EDTA dans es cocktail antiprotéase

21 Les différent type d'inhibition