Transitoires calciques et différenciation neuronale

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1 Transitoires calciques et différenciation neuronale
Neuroblastes de la moelle épinière d’embryon de xénope (HOLLIDAY and SPITZER 1990). Précurseurs neuraux de la zone ventriculaire de néocortex d’embryons de rat (OWENS and KRIEGSTEIN 1998). Cellules de crêtes neurales troncales d’embryons de souris (CAREY and MATSUMOTO 1999). Précurseurs de neurones GABAergiques d’embryons de drosophile (KUPPERS et al. 2003).

2 Transitoires calciques de neurones NT2N humains
B Control Ca2+ 0 mM Nif. 10 µM GVIA 5 µM MVIIC 5 µM Ni 0.5 mM Ni 5 mM Gao et al. 1998, EJN 10:

3 Canaux calciques voltage-dépendants et différenciation neuronale
Les canaux de type L sont indispensables à l’induction neurale chez le xénope et sont régulés par noggin (Leclerc et al. 2000). Les canaux de type N déterminent le phénotype neurochimique GABAergique dans la moelle épinière d’embryons de xénope via une régulation de l’expression de la GAD67 (Watt et al. 2000). L’expression des canaux de type L est corrélée avec la maturation de l’excitabilité de neurones de Purkinje de rats néonataux (Liljelund et al. 2000).

4 Codage fonctionnel des transitoires calciques chez le xénope
Les « spike » calciques de 2-3/h au niveau du soma déterminent la différenciation des neurones GABAergiques (Gu et Spitzer 1995). Les ondes calciques d’environ 8/h au niveau du cône de croissance inhibent la pousse neuritique (Gomez et Spitzer 1999) Les transitoires calciques, d’environ 10/min, des filopodes régulent le guidage axonal (Gomez et al. 2001).

5 Rôle des canaux calciques dans la différenciation neuronale
Méthodologie: Pharmacologie et électrophysiologie in vitro. Transgenèse Clonage in silico de canaux Modulation in vivo des courants Microscopie multiphotonique in vivo

6 Modèle animal : Xenopus laevis et tropicalis

7 Advantages du modèle Modèle d’ embryologistes
Milliers d’oeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2007 par le “Joint Genome Institute » au NIH. F. TIAHO

8 Mark’s Modified Medium
F. TIAHO Advantages du modèle METHODES: solutions Modèle d’ embryologistes Milliers d’oeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH. Dissection Mark’s Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM CaCl mM MgCl mM Hepes 5 mM pH 7.8 Dissociation Barth Medium NaCl mM KCl mM NaHCO mM Na2HPO mM KH2PO mM EGTA mM pH Culture CaCl2 ±0.5 mM EGTA ± 1 mM F. TIAHO

9 1. Couteau 2. Raquette Pointe de pipette Pasteur Fil de platine

10 METHODES in vitro: dissection et culture des cellules neurectodermiques
B D C A 1 mm C.I. Neurone C.E. 20 µm

11 Exemples de neurones

12 Propriétés des neurones différenciés Advantages du modèle
F. TIAHO F. TIAHO F. TIAHO Propriétés des neurones différenciés Advantages du modèle METHODES: solutions Analyses des neurones différenciés Modèle d’ embryologistes Milliers d’oeufs de grandes tailles. Chorion transparents et développement externe des embryons. Table de développement embryonnaire établie. Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser. Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin. Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires. Modèle de génétique: Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH. La calcein-AM et le propidium iodide sont utilisés pour distinguer les cellules vivantes et mortes. Les neurones sont identifiés par le critère morphologique. Le nombre de neurones ou leur pourcentage dans chaque boîte de Petri sont déterminés. Pour les statistiques, les tests de  ou t-test de student sont utilisés. Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Olympus IX70). Dissection Mark’s Modified Medium NaCl100 mM KCl 2 mM CaCl mM MgCl mM Hepes 5 mM pH 7.8 Dissociation Barth Medium NaCl mM KCl mM NaHCO mM Na2HPO mM KH2PO mM EGTA mM pH Culture CaCl2 ±0.5 mM EGTA ± 1 mM Immunologie Ils sont tous 3A10 positifs. Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma. Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium. Dans les expériences suivantes les neurones sont définis par des critères morphologiques uniquement. F. TIAHO

13 METHODES in vitro: 1. Immunocytofluorescence 2. Electrophysiologie A1
Neurone Anti-islet1 Anti-myosin 1. Immunocytofluorescence 3A10 A1 A2 20 µm 2. Electrophysiologie -350 pA -20 mV 0 mV A Current clamp B Voltage clamp I (nA) Vm (mV)

14 Propriétés des neurones différenciés
F. TIAHO Propriétés des neurones différenciés Immunologie Ils sont tous 3A10 positifs. Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma. Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium. Pour dénombrer en routine les neurones dans les cultures nous utilisons le critère morphologique

15 Bilan des résultats BTX ATP IGF Ach Ca2+ Ca2+ GVI-A Ca2+ Ca2+ ? ? Ni
TRP ? ? Ni Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Dépolarisation Différenciation neuronale F. TIAHO

16 Planification de la culture cellulaire
Groupe1 Groupe2 Groupe 1A Groupe 1B Groupe 2A Groupe 2B Mercredi AM Prép. solutions Observation culture Dissection Mercredi PM Culture Jeudi AM Comptage Jeudi PM Vendredi AM Vendredi PM

17 FICHE-GROUPES GROUPE 1A GROUPE 1B Nombre NOM PRENOM 1 2 3 4 5
GROUPE 1A GROUPE 1B Nombre NOM PRENOM 1 2 3 4 5 GROUPE 2A GROUPE 2B 6 7 8 9 10