Production de protéines recombinantes chez les plantes

Présentation au sujet: "Production de protéines recombinantes chez les plantes"— Transcription de la présentation:

1 Production de protéines recombinantes chez les plantes
« Molecular farming »

2 Définition « Molecular farming » :
Production de protéines d’intérêt pharmaceutique par des organismes recombinants Ne rentre pas dans cette définition : La production d’anticorps anti-pathogènes de plante chez le blé Franken et al. (1997) Curr Opin Biotech.

3 Les protéines thérapeutiques, un marché en pleine expansion
Prévision 2010 : 60 milliards de $ Pissara (2004) Nature Biotech.

4 Production de protéines recombinantes
Le plus simple : Production d’insuline par une bactérie Le plus complexe: Production de complexes à plusieurs sous-unités (IgA) par une plante de grande culture

5 Actuellement : virage technologique
Abaissement drastique des coûts de production en systèmes hétérologues Bouleversement important à venir dans les pratiques médicales

6 Avant tout : quelle protéine exprimer ?
Démarche Caractérisation d’une protéine d’intérêt pharmaceutique Clonage, mise au point de la production Exemple 1921 : l’insuline facteur anti-diabète 1951 : séquençage peptidique 1982 : expression en bactérie 1997 : première autorisation de mise sur le marché Fisher et Emans (2000) Transgenic Res.

7 L’expression en bactérie fonctionne exceptionnellement bien
Mais…. L’insuline est une protéine simple : Faible poids moléculaire non glycosylée L’expression en bactérie fonctionne exceptionnellement bien

8 Production de protéines complexes
Organismes eucaryotes Levures Cellules animales : lait, urine Cellules d’insecte : système baculovirus

9 Le végétal comme système d’expression
Milieux de culture simples et peu coûteux / cultures animales De l’eau, du substrat et du soleil Possibilité de monter en échelle la production Filière des plantes protéagineuses Applications médicales très « gourmandes » en quantité de protéines Stabilité des protéines dans les organes de stockage

10 Le végétal comme système d’expression
Maturation des protéines similaire aux mammifères Pas de pathogènes pour l’homme Pas d’endotoxines

11 Premiers succès de production chez les plantes
Hormone de croissance humaine Interférons (antiviraux - anticancéreux) Sérum albumine humaine

12 1989 : production d’anticorps par des plantes
Production de sous-unités lourdes () et légères () d’une IgG dans des lignées différentes de tabac Assemblage par croisement des lignées Obtention d’anticorps réactifs (contre la BSA) par test ELISA Hiatt et al . (1989) Nature

13 Le « boom » technologique
Depuis 1990, dans des systèmes végétaux Anticorps Vaccins Facteurs sanguins Facteurs de croissance hématopoïétiques Effecteurs biologiques : interleukines Etc… 198 autorisations d’essais au champ entre 1991 et 2002 aux USA Production compatible avec des tests pré-cliniques

14 Production de peptides antigéniques
Production de vaccins Production de peptides antigéniques

15 Exemples d’applications
Hépatite B Choléra Diarrhées causées par E. coli

16 Vaccination orale de souris (Mus musculus) contre l’hépatite B
Production d’antigènes de surface de l’HBV dans des tubercules de pomme de terre Consommation de tubercules crus

17 Injection unique de vaccin commercial
Richter et al Nature Biotechnology Anti-HBs (miU / ml) Semaines Injection unique de vaccin commercial

18 Problèmes liés à la vaccination orale
Pomme de terre > 100 g de tubercule cru !! Banane Palatabilité supérieure Reste le problème de la quantité Améliorations Niveaux d’expression Adjuvants

19 Production d’immunoglobulines

20 Immunoglobulines Diagnostique Thérapeutique Anti-IgG
Caries dentaires (CaroRx®, PlanetBiotechnology) Ciblage de cellules cancéreuses pour la radiothérapie (Monsanto)

21 Autres biomédicaments

22 Exemples de biomédicaments
Lipase recombinante dans l’endosperme de maïs (=Meripase® produite par Meristem Therapeutics à Clermont Ferrand) Lactoferrine dans le riz (Ventria Bioscience)

23 Protéines pharmaceutiques pour animaux
Stimulateurs du système immunitaire pour les crevettes ImmunosphèreTM Feed Additive Prodigene : anti-diarrhéique produit dans le maïs utilisé chez le porc

24 Purification des peptides
Technologie corps lipidique / oléosine Exsudation racinaire des protéines

25 Technologie corps lipidiques / oléosine
SemBioSys Genetic inc. Oléosines : Protéines organisatrices des gouttelettes lipidiques Fusion de protéine :: oléosine

26 Gene oléosine Fusion oleosin + gène X Adressage Traduction

27 Purification des protéines
Homogénéisation Séparation Corps lipidiques Protéases Graines broyées Extraits cytoplasmiques Corps lipidiques Homogénéisation de la phase lipidique avec du tampon d’extraction Protéines recombinantes

28 Une oléagineuse alternative pour la production de protéines
Carthamus tinctorius Problèmes de propriété pour les plantes de grande culture Pas de mauvaise herbe apparentée dans l’hémisphère nord

29 Exsudats racinaires Purification des protéines :
Jusqu’à 90% du coût de production Système d’exsudation racinaire Exsudation de substances carbonées (dont protéines) Rhizosphère : racine + microflore

30 Exsudats racinaires xylanase bactérienne
Motif d’adressage RE  sécrétion dans le milieu extracellulaire Digestion d’un substrat (RBB xylane) Témoin 35S:xylanase Borisjuk 1999 Nature Biotechnology

31 Le problème de la glycosylation

32 Les plantes ont le même « cœur » que les mammifères
Chez les bactéries : pas de glycosylation Chez les levures : Polymannose glycanes Chez les mammifères et végétaux Le « cœur» est formé de deux résidus N-acetylglucosamine

33 N-glycosylation des protéines

34 Gomord et al. 2005 Trends in Biotechnology

35 Des différences qui posent problème…
Dans certains cas, protéines recombinantes non-fonctionnelles Résidus potentiellement immunogéniques Allergie aux pollens : IgE spécifiques des N-glycanes de plantes Les planticorps sont plutôt déconseillés pour une administration parentérale Usage ectopique ou oral

36 Impact sur le choix du système d’expression
Profils de glycosylation différents D’une espèce à l’autre Age des tissus Choisir une espèce / tissu / stade physiologique le plus favorable Le plus de % mannose possible

37

38 Enrichissement en résidus riches en mannose
Gomord et al Trends in Biotechnology

39 Humanisation des protéines recombinantes
Chez les végétaux : pas de β1,4- galactosyl-transférase Peut on modifier le système de glycosylation des plantes ?

40 Coexpression d’une GalT
Anticorps Galactosyl transférase Anticorps + GalT

41 Anticorps Anticorps + GalT GlcNacß1-2Man1-3/6 Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc
Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-6 Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-3 Fuc 1-3 Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc Problème résiduel Bakker et al. (2001) PNAS

42 Cependant… Les humains sont exposés constamment aux glycoprotéines de plantes Même des protéines complètement humanisées peuvent se révéler immunogènes Pas de prédictibilité pour le caractère allergénique des protéines recombinantes

43 Le suivi post-marketing des patients est un impératif dans le domaine des biomédicaments
Gomord et al Trends in Plant Science

44 Culture en plein champ

45 Cultures en plein champ
Avantages Faible investissement en technologie agricole Fort potentiel de changement d’échelle de production (« scalability ») Inconvénients Mise au point des itinéraires techniques Variabilité climatique Difficulté d’appliquer des normes de bonnes pratiques de fabrication courante (BPFc) Problèmes de dissémination

46 Quelques scandales ayant marqué les esprits
Affaire Prodigene : En 2003, une contamination dans le Nebraska d’une récolte de soja par des rejets de maïs produisant une protéine thérapeutique utilisée contre la diarrhée chez le porc provoque une révision des conditions de sécurité appliquées aux USA. La même année des maïs conventionnels avaient été contaminés dans l’Iowa par du maïs prodigene  Greenpeace s’empare du sujet Amende $ Affaire Starlink : Maïs contenant un insecticide Cry9C interdit pour la consommation humaine mais autorisé pour la consommation animale. Pendant l’année 2000, on en retrouve dans plus de 300 produits  amende historique

47 Stratégies de confinement
Exemple de Meristem Therapeutics Isolement géographique Isolement temporel Stérilité mâle Matériel de récolte dédié Exemple de Biolex Therapeutics Lentille d’eau (Lemna minor) Production confinée Pas de pollen, pas de consommation Productivité très importante

48 Conclusion Expression hétérologue dans un système végétal :
Nombreuses applications au stade pré-industriel Un système d’expression qui peut s’avérer tout à fait concurrentiel dans certains cas Très gros potentiel de développement