Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif immunisée ou non A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital.

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1 Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif immunisée ou non A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

2 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh
Protéine RHD : protéine transmembranaire du Globule Rouge 15000 sites par GR RhD+ A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

3 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH
Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

4 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL PROFIL GENOTYPIQUE RHD
Personnes RhD négatif Haplotype I III IV VI X X I Gène Dy cDye duplication Stop I III IX X X I Gène Hybride D-CE-D (C)ces/ce X I cde Cde cdE Gène D délété Rh box hybride Caucasiens RhD Négatif (15 %) < 1% < 1 % > 99 % Noirs Africains RhD Négatif (3%) 10-20 % 60-70 % 10-25 % Gène(s) hybride(s) D-CE-D Gène(s) D muté(s) non fonctionnels Gène D délété

5 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel
Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes (1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire) LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD – - Diagnostic non invasif Quantité de Génomes (copies par ml de plasma maternel) 25 (3 à 70) à 15 S.A. 290 (77 à 769) à terme Persistance in vivo Demi-vie < 1 heure Isolement Rapide, simple ADN fœtal dans le plasma A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

6 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml) 72h max entre prélèvement et réception au laboratoire Centrifugation puis décantation plasma 1 Extraction de l’ADN plasmatique 2 Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD 3 A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

7 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD : - EXON 10 (plus sensible mais moins spécifique) - EXON 7 ( plus spécifique mais moins sensible) - EXON 5 (permet l’exclusion d’un maximum de variants du gène D silencieux) Les 3 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test et détecter un maximum de variant du système RH A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

8 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
EXON 7 + ORIGINE DE L’ADN AMPLIFIE Maternelle Fœtale ININTERPRETABLE RHD POSITIF EXON 10 GENOTYPAGE FOETAL EXON 5 EXON 7 - VERIFICATION EXTRACTION ADN traceur négatif RHD NEGATIF à vérifier Sur un second prélèvement EXON 10 GENOTYPAGE FOETAL ADN Traceur positif RE-EXTRACTION EXON 5 Si DISCORDANCE entre les EXONS : problème de variants RHD (identification possible en fonction de la positivité de chacun des exons ou INDETERMINE) A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

9 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
PREVENTION DES FAUX- NEGATIFS REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT POUR ECARTER LE RISQUE « LOURD » DE FAUX NEGATIF 1) Concentration plus élevée d’ADN fœtal 2) Rattraper une erreur d’étiquetage 3) Rattraper un croisement pré-analytique des échantillons FAUX- POSITIFS 1 % dans la population caucasienne Spécificité du test en tant que facteur prédictif du phénotype n’est pas parfaite : présence de variants silencieux fœtal du gène RHD hérité du père A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

10 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL SERIE DE LA LITTERATURE
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

11 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Kit de 1ère génération
Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE (INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY) Trousse développée en Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter fluorescent. Marquage CE obtenu en JUIN 2007 Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman ADN marqueur : maïs Free DNA Fetal Kit® RhD Kit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN foetal libre du sang maternel (Technique PCR Temps réel) Réf. : A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

12 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION
Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement : Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine. Par des praticiens agrées par l’Agence de Biomédecine. OBLIGATION D’UN CONSENTEMENT DE LA PATIENTE (préalable à une analyse de biologie moléculaire en vue d’établir un diagnostic prénatal in utero) A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

13 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
FEMME RHD – IMMUNISEE ANTI- D INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL DES 12 SA FOETUS RHD – Confirmer sur un second prélèvement Pas de surveillance spécifique PAS DE SITUATION D’INCOMPATIBILITE FOETUS RHD + INCOMPATIBILITE FOETO-MATERNELLE Mise en place d’une surveillance anténatale : BIOLOGIQUE (dosage pondéral) OBSTETRICALE (vélocité-doppler à l’artère cérébrale moyenne du fœtus) PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE ANTENATALE OBSTETRICALE ET BIOLOGIQUE PARTICULIEREMENT CONTRAIGNANTE A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

14 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE Ponction de trophoblaste
FEMME RHD – NON IMMUNISEE Amniocentèse Ponction de trophoblaste au minimum 1 semaine avant le geste invasif INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL FOETUS RHD + Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse FOETUS RHD- Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h. A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

15 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
386 dossiers de femmes RHD- candidates à une amniocentèse Etude sur 3 maternités 342 dossiers étudiés 32 exclus car refus PLA ou urgent 310 SANS GENOTYPAGE NON INVASIF 102 AVEC GENOTYPAGE NON INVASIF 208 117 SAT ROT RDB 100 % traitées 55,5 % RHD+ 39,3 % RHD- 1,71 % Indéterminé 3,42 % Ininterprétable 100 % traitées 12,5 % traitées Réception résultat en moyenne 7 jours après Etude Siham Boujida, sage femme maternité St Antoine Concordance génotypage LA/ sang maternel : 99 % A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

16 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
FEMME RHD – NON IMMUNISEE Amniocentèse Ponction de trophoblaste Sans Amniocentèse INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL au minimum 1 semaine avant le geste invasif A partir de 12 SA FOETUS RHD + Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse FOETUS RHD- Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h. FOETUS RHD + Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI itératives (environ femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+) A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

17 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL GENIFERH
Projet STIC : Génotypage RHD fœtal non invasif systématique Paris-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes   Objectif principal Évaluer le rapport coût-efficacité (4000 patientes) de l’application systématique du génotypage RhD fœtal non invasif sur l’application de l’immunoprophylaxie RhD et la pratique habituelle de suivi des femmes enceintes RhD négatif des maternités en France (RPC 2005) Objectifs secondaires Faisabilité de la stratégie de génotypage RhD fœtal systématique Analyser les génotypages « indéterminés » et les discordances génotypes-phénotypes Aide à la décision publique de diffusion du génotypage RHD fœtal non invasif au sein du réseau français de soin en obstétrique et du tarif de remboursement du test. A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

18 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL CONCLUSION
FEMME ENCEINTE RHESUS D NEGATIF FEMME IMMUNISEE FEMME NON IMMUNISEE PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE ANTENATALE AMNIOCENTESE SANS AMNIOCENTESE PERMET D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF DEVRAIT PERMETTRE D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF (40%) A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine

19 CALENDRIER DE LA GROSSESSE EN SEMAINES D’AMÉNORRHÉE
SCHEMA de l’ETUDE GENIFERH 1 CALENDRIER DE LA GROSSESSE EN SEMAINES D’AMÉNORRHÉE 12 RAI 3e trimestre 26 27 28 29 30 (4 dernières semaines) Accouchement + 72h GROUPE MATERNITE GENOTYPAGE INCLUSION ÉQUIPE OBSTÉTRICALE - Vérification critères .Femme > 18 ans .Grossesse de 8 à 26 SA .Rh D Négatif non immunisée .pas ATCD génotype invasif .Accoucht prévu Mater réseau - Information -Signature consentement -Remise ordonnance au groupe « génotypage » Recueil N°1 données: Démographie, suivi de grossesse, immunohématologiques, Immunoprophylaxie A ENVOYER: FAX INCLUSION - à URCEST : - au LABORATOIRE . Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité . Immunoprophylaxie RhD en fonction du résultat du génotypage ACCOUCHEMENT ÉQUIPE OBSTÉTRICALE Recueil N°2 données: * Patiente Prophylaxie Rh ciblée et systématique Données immuno-hématologiques Consultations / hospitalisations * Nouveau-né Démographie Phénotype A ENVOYER: FAX ACCOUCHEMENT à URCEST au LABORATOIRE Prélèvement N°1 pour GÉNOTYPAGE Prélèvement N°2 (si N°1 RhD-) pour GÉNOTYPAGE GROUPE MATERNITE TEMOIN .Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité . Immunoprophylaxie RhD selon RPC 2005 LABORATOIRE : SAISIE des données biologiques mère (extemporané) et nouveau-né (phénotype à la naissance) TRANSMISSION des résultats génotypage non invasif à la maternité (tel +fax investigateur) A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine