Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique

Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique
Grégory Genta-Jouve –

Introduction La métabolomique est l’étude chimique des métabolites présents dans un système biologique (tissu, cellule, organe, organisme) à un instant donné. Cette approche découle des études « omiques » qui sont fortement utilisées aujourd’hui. génomique transcriptomique protéomique métabolomique Reflètent ce qui peut se passer Reflète ce qui se passe

Introduction Qu’est ce qu’un métabolite?
C’est une petite molécule organique ayant une masse moléculaire généralement inférieure à 2000 uma. colchicine phorbaside A L-tryptophane acide laurique manzamine A testosterone adénine parazoanthine C Incluant les acides aminés, sucres, lipides, acides nucléique, terpènes, polycétides, alcaloïdes, etc…

Introduction L’ensemble des métabolites présents dans une cellule, tissu, organe ou individu est appelé: métabolome. Il inclut des métabolites endogènes (produits par l’organisme) ainsi que des métabolites exogènes (provenant de l’extérieur). Il est défini par les techniques analytiques qui permettent de le caractériser. Il est variable selon les espèces, mais aussi en fonction du temps, de l’environnement, du stade physiologique ou pathologique.

Introduction Le métabolome humain:
Il est constitué de plus de métabolites répartis dans différentes catégories: - détectés et quantifiés: 2904 - détectés mais non quantifiés: 1114 - attendus mais non quantifiés: 2700 - provenant de la salive: 702 - provenant de l’urine: 3995 - provenant du sang: 4535 - etc… Beaucoup de métabolites restent à identifier pour compléter la caractérisation du métabolome humain. Wishart D S et al. Nucl. Acids Res. 2013;41:D801-D807

Introduction Pourquoi faire de la métabolomique?
- >95% des diagnostics médicaux sont réalisés par dosages de petites molécules. - la grande majorité des médicaments utilisés sont des petites molécules. - les métabolites servent de co-facteurs à plusieurs milliers de protéines - un grand nombre de maladies génétiques sont dues à un dérèglement dans le métabolisme de petites molécules. - elle donne une image du métabolisme à un instant t qui permet de comprendre les mécanismes du métabolisme.

Introduction Applications de la métabolomique? Agrochimie Médecine
Ecologie chimique Taxinomie

La métabolomique en pratique
Les différentes étapes d’une étude métabolomique: Collecte des échantillons Préparation des échantillons Acquisition des données Analyse des données

La collecte des échantillons A peu près n’importe quel type d’échantillon peut être analysé dans le cadre d’une étude métabolomique.  Cela dépend du type de détection disponible. Dans le domaine médical, les fluides corporels comme le sang, l’urine ou la salive restent les plus utilisés. D’autres échantillons peuvent aussi être utilisés: -tissus -selles -cultures cellulaires

Préparation des échantillons Une préparation préalable à l’analyse est nécessaire à l’obtention de données de qualité. La préparation des échantillons est souvent très spécifique car elle est réalisée en fonction des métabolites cibles, plusieurs étapes sont cependant constantes: - extraction des métabolites avec un solvant - centrifugation pour séparer les métabolites solubles du reste de l’échantillon. - évaporation du solvant afin de peser la matière extraite - re-suspension à une concentration déterminée et identique pour tous les échantillons.

Acquisition des données L’acquisition des données est souvent réalisée en utilisant les techniques analytiques modernes comme la spectrométrie de masse (SM) et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Plusieurs autres techniques analytiques sont aussi utilisées: - infra-rouge - RAMAN - etc… Nous ne traiterons que la SM et RMN.

Acquisition des données Il existe deux type d’approche: la métabolomique ciblée et la métabolomique non-ciblée. La métabolomique ciblée permet de quantifier de manière très précise plusieurs métabolites dans un échantillon. Il est nécessaire de connaitre la structure des métabolites cibles.  répondre à une question biologique en validant une hypothèse.  suivre les changements de concentration des métabolites d’un même cycle dans diverses conditions. Riekelt H. Houtkooper et al., Scientific Reports 1:134 doi: /srep00134

Acquisition des données: Métabolomique ciblée L’acquisition des données dans le cadre d’une approche ciblée peut être réalisée aussi bien par SM que par RMN. Tandis qu’il n’y a pas de différences significatives entre les différents spectromètres RMN, plusieurs technologies existent pour les spectromètres de masse. Aalim M. Weljie et al., Anal. Chem., 2006, 78 (13), pp 4430–4442

Acquisition des données: Métabolomique ciblée Pour une analyse ciblée, il existe une architecture spécifique de spectromètre de masse: le triple quadripôle.

Acquisition des données: Métabolomique ciblée La quantification des métabolites est réalisée en traçant une courbe d’étalonnage pour chaque molécule à quantifier. Dans les études ciblée, la représentation la plus classique est la boîte à moustaches

Acquisition des données: Métabolomique non-ciblée Deux approches existent pour les études non-ciblées: - approches couplées à la chromatographie (LC-MS, GC-MS) - approches non-couplées: RMN et infusion directe en spectrométrie de masse (DIMS)

Acquisition des données: Métabolomique non-ciblée Dans les études non-ciblées, tous les métabolites (tous ceux qui peuvent être détectés par la technique utilisée) sont listés et quantifiés de manière relative. Temps (min) Intensité

Acquisition des données: Métabolomique non-ciblée Méthodes couplées: Les métabolites sont séparés en fonction de leurs affinités avec une phase stationnaire (LC, GC, etc…)

Acquisition des données: Métabolomique non-ciblée Méthodes non-couplées: les métabolites sont détectés sans séparation préalable (DIMS, RMN). Dans les analyses non couplées, la résolution joue un rôle important pour l’identification des métabolites. ? ? DIMS RMN 1H

Acquisition des données: Métabolomique non-ciblée Les données brutes sont traitées pour permettre: - la correction de l’erreur analytique introduite pendant l’acquisition. - la détection des entités présentes dans l’échantillon - la quantification relative des entités présentes - la comparaison des différents échantillons par des méthodes statistiques

Analyse des données Les données obtenues en utilisant des approches ciblée ou non-ciblée sont analysées en utilisant les statistiques (uni- et multi-variées). Analyse uni-variée: Est-ce que l’une des moyennes des trois classes est significativement différentes? Analyse multi-variée: Elle permet de décrire ou d’expliquer l’information obtenue.

Analyse des données Identification des biomarqueurs Le but de l’analyse métabolomique est l’identification de métabolites permettant de différencier deux populations. La différence peut être qualitative ou quantitative Différence qualitative: un ou plusieurs métabolites se trouvent dans une population mais pas dans l’autre.  approche non-ciblée Différence quantitative: la différence entre les populations est basée sur la concentration d’un ou plusieurs métabolites.  approche ciblée

Analyse des données Identification des biomarqueurs La caractérisation structurale reste la difficulté majeure dans les études métabolomiques. La différence avec la référence de l’identification qu’est la chimie des substances naturelles réside (le plus souvent) dans l’utilisation d’une seule technique (SM ou RMN). Exemple de la proline: m/z Formule brute: C5H9NO2

Analyse des données Identification des biomarqueurs Exemple de la proline:

Analyse des données Identification des biomarqueurs Exemple d’une mélange complexe: Développement d’algorithmes permettant de mettre en évidence les signaux correspondant à un ou plusieurs métabolites d’intérêt.

Identification des métabolites par SM
Le spectre masse Plusieurs éléments sont visibles sur le spectre de masse: - la valeur m/z de la molécule ionisée (en fonction du type et du mode d’ionisation utilisé) - l’abondance isotopique (rapport des pics M, M+1 et M+2) qui définit le massif isotopique. Molécule ionisée M+1 M+2

La valeur de m/z: Elle est le premier élément dans le processus d’identification des métabolites. Une bonne mesure de cette valeur est primordiale et c’est pour cette raison que les appareils utilisés pour les études métabolomiques permettent une mesure précise de cette valeur ( < 5 ppm). Elle permet de déterminer la formule brute du métabolite d’intérêt. Exemple de la proline m/z avec une erreur de 5 ppm: - deux possibilités C5H9NO2 ou C3H7N4O Attention!!!

La valeur de m/z: Le nombre de possibilités dépend du nombre d’éléments admis pour le calcul. Exemple de la proline m/z avec une erreur de 5 ppm et avec les éléments suivants: CHNO - deux possibilités C5H9NO2 ou C3H7N4O Si ajoute d’autres éléments: CHNOPS - trois possibilités C5H9NO2 ou C3H7N4O ou C6H12P Si ajoute d’autres éléments: CHNOPSF - quatre possibilités C5H9NO2 ou C3H7N4O ou C6H12P ou C5H8N2F On note que le nombre augmente avec le nombre d’éléments même pour une valeur de m/z faible.

La valeur de m/z: Exemple d’un métabolite ayant une valeur de m/z avec une erreur de 5 ppm et avec les éléments suivants: CHNO - 4 possibilités Si ajoute d’autres éléments: CHNOPS - 13 possibilités Si ajoute d’autres éléments: CHNOPSF - 44 possibilités Vitamine C Même pour un métabolite simple comme la vitamine C la valeur m/z ne permet pas de trouver la formule brute.

La valeur de m/z: Pour permettre de réduire le nombre de possibilités obtenues en calculant les formules brutes possibles, des règles ont été proposées. Les 7 règles d’or: Réduire le nombre d’éléments Utiliser les règles LEWIS et SENIOR Filtrer grâce au massif isotopique Vérifier le ratio H/C Ratio des hétéroatomes Probabilité des éléments TMS check Tobias Kind et al. BMC Bioinformatics 2007, 8:105

La valeur de m/z: Application des 7 règles d’or: sorbitol Tobias Kind et al. BMC Bioinformatics 2007, 8:105

Le spectre de fragmentation: Beaucoup d’informations peuvent être obtenues à partir d’un spectre de fragmentation. Exemple de la proline:

Le spectre de fragmentation: Exemple de la quercétine:

Le massif isotopique: Une information importante peut être extraite en analysant le massif isotopique d’une molécule ionisée. L’abondance isotopique étant connue pour tous les éléments, il est possible de simuler l’abondance isotopique théorique associée à une formule brute. Exemple: m/z C6H8O6 C6H9N2O2Cl

Trois éléments fondamentaux permettent l’identification des métabolites: Utiliser le massif isotopique Déterminer m/z avec une grande précision Le spectre de fragmentation

Identification des métabolites par RMN
L’identification des métabolites par RMN requiert l’utilisation d’une base de données (HMDB, nmrdb, nmrshiftdb2). Les valeurs de déplacements chimiques sont comparées avec les valeurs présentes dans les bases de données pour permettre l’identification. La RMN est une méthode quantitative, ce qui implique que tous les signaux d’un même métabolite doivent être présents sur le spectre. Cette propriété permet de discriminer des métabolites possédant des mêmes déplacements chimiques.

L’étape clé de l’identification par RMN est la déconvolution du spectre. Mélange Métabolite A Métabolite B Métabolite C

La déconvolution consiste à déterminer la contribution de chaque métabolite sur le spectre observé.

Exemple (réalisé avec Bayesil): Il est ainsi possible de quantifier un grand nombre de métabolites présents dans l’échantillon.

Les applications

Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique

Présentations similaires

Présentation au sujet: "Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique"— Transcription de la présentation:

Présentations similaires

Notre projet

Feed-back

Entrer

S'autoriser via un réseau social:

Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique

Présentations similaires

Présentation au sujet: "Analyses des mélanges complexes: Introduction à la métabolomique"— Transcription de la présentation:

Présentations similaires

Notre projet

Feed-back