TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE

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1 TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE
ED n°2, DCEM1 Purpan,

2 Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie
Immunohistochimie Biologie moléculaire Cytométrie en flux Télépathologie

3 Immunohistochimie Techniques Interprétation Matériel
coupes en paraffine ou coupes en congélation Mode de visualisation Immunofluorescence (UV) Immunoenzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline- lumière blanche) Interprétation batterie d’anticorps témoins intrinsèques, réactivité croisée

4 Immunohistochimie 1 = Antigène 2 = Anticorps primaire
3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase

5 Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique
Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire (ex: agent pathogène)

6 Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique
Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

7 Ag HbS

8 Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique
Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

9 Immunohistochimie Exemple
utilisation des anticorps monoclonaux dans le diagnostic des tumeurs malignes sur coupes en paraffine Tumeurs KL1 Anti-LCA (CD45) Anti- PS100 HMB45 Carcinome + - Lymphome Sarcome +/- Mélanome

10 Immunohistochimie applications

11 Ganglion médiastinal HE

12 Ganglion médiastinal HE

13 Ganglion médiastinal IHC anti-CD45

14 Ganglion médiastinal IHC KL1

15 KL1+ Anti-CD45- Métastase ganglionnaire d’un carcinome

16 Tumeur cutanée indifférenciée

17 Tumeur cutanée indifférenciée: IHC KL1

18 Tumeur cutanée indifférenciée:IHC HMB45

19 Tumeur cutanée indifférenciée: IHC anti-protéine S100

20 KL1- HBM45+ Anti-PS100+ Mélanome

21 Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique
Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

22 Ganglion cervical métastatique, HE

23 Métastase d’un adénocarcinome thyroïdien
Ganglion cervical métastatique: IHC anti-thyroglobuline

24 Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique
Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche micrométastases pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

25 Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire
Mélanome et ganglion sentinelle: recherche de micrométastase par immunohistochimie avec HMB45, non décelable sur H&E Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire

26 Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie
Immunohistochimie Biologie moléculaire hybridation in situ PCR Cytométrie en flux Télépathologie

27 Biologie moléculaire Hybridation in situ Techniques Applications
Coupes en paraffine ou coupes en congélation Sondes froides (= non radio-actives) Chromogéniques (CISH) Fluorescentes (FISH) Applications Détection du génome de certains virus Détection de translocations chromosomiques, d’amplification génique

28 HPV

29 Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand
Détection par FISH d’une fusion entre les chromosomes 17 et 22 dans une lésion cutanée Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand

30 Utilité thérapeutique Prescription d’un inhibiteur de Erb-2
Détection par FISH d’une amplification du gène HER2 dans un carcinome mammaire DuoCISH™, Dako HER2 / Cen17 Non amplifié Amplifié Utilité thérapeutique Prescription d’un inhibiteur de Erb-2

31 Biologie moléculaire PCR (Polymerase Chain Reaction)
Rappel de son principe Technique Applications

32 1/ Principe de la PCR 3 étapes: - dénaturation thermique: 94°C, 30s à 1 mn - hybridation des amorces (annealing): 40 à 70°C,1 min - élongation: 72°C, durée variable selon le fragment à amplifier Dénaturation + Hybridation + Elongation = 1 cycle au cours duquel quantité ADN cible x 2. Au bout de n cycles: 2n molécules ADN cible.

33 2/ Principales étapes de la technique

34 3/ Applications en anatomie pathologique
Anomalies géniques Mutation Translocations chromosomiques Mise en évidence de la clonalité lymphoide

35 Mutation Ex: mutation du gène BRAF dans le mélanome métastatique
Séquençage du produit PCR correspondant à l’amplification de la zone du gène où se situe la mutation Intéret thérapeutique (prescription d’un inhibiteur de BRAF)

36 Translocation chromosomique
Détection par PCR à l’aide de deux amorces encadrant la zone réarrangée CHR 2 CHR 5 Amorce A Amorce B Gène A Gène B Intérêt diagnostique (translocation spécifique de tumeur) Intérêt pronostique (ex: recherche de la maladie résiduelle après traitement d’un lymphome porteur de cette translocation)

37 Prolifération polyclonale bénigne Prolifération monoclonale maligne
Polyclonalité et monoclonalité lymphoide Prolifération polyclonale bénigne Prolifération monoclonale maligne Comment établir le caractère clonal ou polyclonal ? Identité ou non-identité du récepteur à l’Ag qui caractérise un lymphocyte donné Ig pour lymphocyte B TCR pour lymphocyte T Intérêt diagnostique

38 Etablissement de clonalité par PCR
V D J Monoclonal Etablissement de clonalité par PCR V D J Polyclonal

39 Contraintes a- ADN de bonne qualité * délai de congélation * qualité et temps de fixation (Formol) b- Contaminations lors des coupes (changer de lames, de gants entre chaque cas, nettoyer le support de lames) lors de toutes les phases d’extraction d’ADN, d’amplification et d’électrophorèse. c- Contrôles : Témoin négatif (eau) Témoin positif

40

41 Les immunoglobulines (Ig): récepteurs à l’antigène des lymphocytes B
Partie variable des Ig: carte d’identité d’un lymphocyte B

42 La diversité combinatoire

43 La diversité jonctionnelle 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT)
1/ Délétion de nucléotides en aval de V, en amont de J ou de part et d’autre de D 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT) V N J C2 Zone jonctionnelle D

44

45 PCR 1- BREF RAPPEL double hélice ADN A T T G C T A A C G A T T G C
2 brins antiparallèles enchaînement de bases reliées entre elles par des liaisons hydrogènes faibles et thermolabiles : A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G dénaturation thermique molécule double brin 2 molécules simple brin

46 Applications Maladies infectieuses :
Virus (HPV : non cultivable,CMV: rejet de greffe rénale, VIH...), bactéries (à croissance lente : mycobactéries)… Anomalies géniques - Mutation - Translocation chromosomique détection de la t(14;18) par PCR: amplification de la zone jonctionnelle, variable d’un clone à l’autre. t(2 ;5) et lymphomes anaplasiques à grandes cellules - Etablissement de la clonalité lymphoïde CHR 2 CHR 5 amorce