Présenté par Catherine Gravel Supervisé par Dr Hugo Soudeyns

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1 L’épuisement clonal des lymphocytes T CD8+ après transplantation de sang de cordon ombilical
Présenté par Catherine Gravel Supervisé par Dr Hugo Soudeyns Département de microbiologie et d’immunologie Université de Montréal

2 POURQUOI: Traiter des patients atteints maladies hématologiques : aplasies médullaires congénitales ou acquises, hémoglobinopathies, syndromes myélodysplasiques, leucémies aigue (lymphoblastique et myéloblastique) QUAND: Puisque la TSCO est une procédure lourde et invasive, on y a seulement recours lorsque les patients ne réponde pas au traitement conventionnel BUT: Le but d’une TSCO est de remplacer MO patient qui produit des cellules immunitaires malignes ou défectueuses COMMENT: Pour y arriver, le patient est soumis à une étape de conditionnement (fortes doses chimiothérapie et radiothérapie) qui élimine les cellules malignes ou défectueuses et fait de la place dans MO Certains centre : Pour être certain qu’il ne restera pas de cellules T matures résiduelles, un traitement immunosuppresseur est administré en complément du conditionnement. Prévenir la réaction du greffon contre l’hôte (en anglais : « graft versus host disease », GvHD). Cette dernière survient lorsque les cellules du donneur reconnaissent les cellules du receveur comme un non-soi, sont activées et attaquent les organes cibles du receveur Transplantation = régénère système sanguin et immunitaire

3 Cellules Souches Hématopoïétiques
Lignée myéloïde = globules rouges, plaquettes, monocytes, granulocytes et cellules dendritiques myéloïdes Lignée lymphoïde = cellules dendritiques plasmoïdes et lymphocytes

4 Sang de cordon ombilical
Source de CSH Moelle osseuse Sang de cordon ombilical Avantages Riche source de CSH Meilleur prise de la greffe Moins d’infections opportunistes Reconstitution plus rapide du système immunitaire et hématopoïétique Moins GvHD Pas risque pour le donneur Pas contaminations virales Permet plus grande disparité entre donneur et receveur (HLA) Inconvénients Maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) Risqué pour le donneur Contamination du receveur par pathogènes présents chez le donneur Moins de CSH (juvénile) Plus de non prise Reconstitution plus lente Plus susceptible aux infections opportunistes Les cellules souches peuvent provenir du sang périphérique, de la MO ou du sang de cordon. taux d’incidence de rechute oscille autour du 20% dans les deux cas. Les lymphocytes T CD8 sont les principales acteurs entrainant ou protégeant contre ces complications Incidence de rechute leucémique autour de 20% dans les deux cas

5 Lymphocytes T CD8+ Cellule présentatrice d’antigène Lymphocyte T
Pour jouer leurs rôles, les lymphocytes T CD8 doivent être activé via un complexe d’activation. Lorsque la menace est contrôlée, des récepteurs inhibiteurs vont être exprimés pour mettre fin à la réponse immunitaire.

6 Récepteurs inhibiteurs
Expression transitoire permet de réguler l’activité des lymphocytes T CD8+ suite à une infection. Lors d’infection chronique et de tumeur, l’expression prolongée provoque un dysfonctionnement des lymphocytes T CD8+ : Épuisement clonal Prte capacité proliférative, capacité de production de cytokines et capacité cytotoxique des cellules T (Wherry, 2011).

7 Épuisement clonal Caractérisé par la perte des capacités:
proliférative cytotoxiques production de cytokines Touche les lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène Lymphocytes T CD8+ épuisées sont distinguables selon les récepteurs inhibiteurs exprimés L’épuisement clonal est sélectif, n’affectant que les cellules immunitaires dominantes spécifiques à l’infection ou à la tumeur (Wherry, 2011). Les cellules épuisées se distinguent des cellules mémoires et effectrices d’un point de vue moléculaire, les définissant comme un état unique de différenciation. BTLA induit inhibition de la production de cytokines. LAG-3 t régule négativement la prolifération cellulaire, l’activation et l’homéostasie des lymphocytes T

8 Recherche antérieure dans notre laboratoire
Notre équipe a démontré : Fréquence des lymphocytes T CD8+ exprimant PD-1 augmente tot apres la greffe puis redescend suite à la TSCO Associé à la rechute leucémique PD-1 (« programmed death 1 ») régule principalement l’apoptose des lymphocytes T une fois l’infection contrôlée. Fréquence des lymphocytes T CD8+ exprimant PD-1 augmente puis redescend suite à la TSCO Associé à la rechute leucémique donc pourrait être un marqueur de rechute (Mérindol et al. 2011)

9 D’autres marqueurs? LAG-3: régule négativement la prolifération cellulaire, l’activation et l’homéostasie des lymphocytes T BTLA: inhibe la production de cytokines

10 Hypothèse La fréquence des lymphocytes T CD8+ exprimant les récepteurs inhibiteurs BTLA et LAG-3 est associée à leur dysfonctionnement et à la rechute suite à une TSCO. Objectif Suivre la fréquence des lymphocytes T CD8+ exprimant BTLA et LAG-3 chez les receveurs de TSCO. Puisque BTLA et LAG-3 ont des fonctions inhibitrices caractérisant l’épuisement clonal, peut-être que l’expression de ces récepteurs est associé à cet état de dysfonctionnement des lymphocytes T suite à une TSCH.

11 Méthodologies Isoler les PBMC des patients
Étude prospective avec suivi de 2 ans Patients pédiatriques, Service d’hémato-oncologie, CHU Sainte-Justine TSCO en traitement d’une leucémie Consentement libre et éclairé Cible de recrutement : 20 patients Isoler les PBMC des patients Marquage des cellules et cytométrie en flux Pour y arriver, on a élaboré une étude prospective avec suivi de 2 ans avec des patients pédiatriques du service d’hémato-oncologie du CHU Sainte-Justine ayant reçu une TSCO en traitement d’une leucémie. Ils ont signé un consentement libre et éclairé et la cible de recrutement est de 20patients. Il faut isoler les cellules mononuclées du sang périphérique des patients, qui seront marquer complexes anticorps-fluorochromes dirigé contre BTLA et LAG3 puis faire une cytométrie en flux.

12 Résultats préliminaires
Stratégie d’acquisition BTLA BTLA / LAG3 LAG3 SSC = side scatter = DENSITÉ FSC = front scatter = TAILLE Lymphocytes = petits et granuleux quand activé CD8 – Horizon V450 CD3 – AlexaFluor 700 Tous les lymphocytes CD8 expriment CD3 en complexe avec leurs TCR donc pas de point en bas/droite Lors de l’acquisition (cytométrie en flux), on veut sélectionner les lymphocytes qui se retrouve en bas puisqu’ils sont de faible taille et densité. Ensuite dans la population de lymphocytes, on va sélectionner ceux qui exprime CD3 et CD8 puisque c’est les lymphocytes T CD8 qui nous intéresse. Sur cette population on va regarder la fréquence d’expression de BTLA et LAG3.

13 Marquages contrôles Afin de vérifier que nos anticorps marche vraiment on procède a plusieurs tests dont celui-ci Puisqu’on sait que BTLA et LAG-3 sont des récepteurs inhibiteurs supposés s’exprimer sur les lymphocytes T CD8+ activés, on active les cellules avec divers agents. On constate que la fréquences de lymphocytes T CD8 exprimant BTLA et LAG3 augmente bel et bien ce qui confirme que nos anticorps lie la bonne chose.

14 Greffés On procede ensuite avec les greffés.
Comme vous pouvez voir, on a testé les cellules du patient 1 (en bleu) a 6 et 12 mois post-greffe. On peut constater une augmentation de la fréquence des lymphocytes exprimant BTLA, LAG et BTLA/LAG puis une diminution. Pour le patient 2, j’ai testé un prélèvement à 3 mois, mais on ne peut pas vraiment tirer de conclusion de ses données parce qu’il n’y avait pas beaucoup de cellules, le patient étant malheureusement en rechute.

15 Conclusions Fréquence lymphocytes T CD8+ exprimant BTLA et/ou LAG3 augmente peu après la greffe puis redescend Ces résultats sont compatibles avec ce qui a été observé avec PD-1 et l’épuisement clonal des lymphocytes T CD8+ On peut donc observé que chez notre patient #1, la fréquence des lymphocytes T exprimant BTLA, LAG et BLTA/LAG3 augmentait pour redescendre. Ces resultats sont compatibles avec ce qui a été observé avec PD-1 et l’épuisement clonal. Pour avoir des resultats significatifs, il faudrait refaire l’étude avec une plus grande cohorte comme prévu au devis sur 20 patients. Si une corrélation entre la fréquence d’expression et la rechute était démontrée, nous pourrions envisager une immunothérapie (à base d’anticorps bloquant les récepteurs) afin de prévenir la rechute chez les patients leucémiques ayant reçu une TSCO.

16 Un cas de rechute de leucémie (patient #2)
Un cas de rechute de leucémie (patient #2). Pour avoir des résultats significatifs, il faudra compléter l’étude tel que prévu au devis (20 patients, suivi de 2 ans)

17 Remerciements Dr. Hugo Soudeyns, Directeur de stage, Unité d’immunopathologie virale, CHU Sainte-Justine Insaf Salem Fourati, Étudiante au Doctorat, Département de microbiologie et immunologie, Université de Montréal Martine Caty, Assistante de recherche, Unité d’immunopathologie virale, CHU Sainte-Justine Dr. Natacha Merindol, Unité d’immunopathologie virale, CHU Sainte-Justine Dr. Michel Duval, Service d’hématologie-oncologie, CHU Sainte-Justine Dre. Françoise Le Deist, Département de microbiologie et immunologie, CHU Sainte-Justine Samira Mezziani, Service d’hémato-oncologie, CHU Sainte-Justine Dr. Martin A. Champagne, Service d’hémato-oncologie, CHU Sainte-Justine Groupe de recherche en transplantation et immunologie du sang de cordon (GRETISC) Société de Leucémie et Lymphome du Canada (SLLC) Comité d’organisation du programme des stages d’été (COPSÉ) Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S)

18 Conclusions Fréquence lymphocytes T CD8+ exprimant BTLA et/ou LAG3 augmente peu après la greffe puis redescend Ces résultats sont compatibles avec ce qui a été observé avec PD-1 et avec l’épuisement clonal des lymphocytes T CD8+ Un cas de rechute de leucémie (patient #2) pour avoir résultats significatif il faut compléter l’étude tel que prévu au devis (20 patients, suivi de 2 ans) En conclusion, nous avons observé que la fréquence des lymphocytes T exprimant BTLA et LAG augmentait chez le patient #1 pour redescendre par la suite. Ce qui a aussi été observé par Mérindol et al. dans un article publié dans Blood pour d’autres récepteurs inhibiteurs (chapitre 3 de la référence Mérindol et al., 2011). Nos résultats sont intéressants même si nous n’avons pas démontré l’épuisement clonal. Il s’agit ici d’une observation originale qui n’a pas encore été rapportée dans la littérature. Dans l’état des choses, il est difficile d’affirmer si ce sont des marqueurs d’activation ou d’épuisement et s’ils jouent un rôle dans la rechute. Il faudrait refaire l’étude avec une plus grande cohorte, suivre la fréquence d’expression tout en étudiant son impact sur les propriétés fonctionnelles des lymphocytes post-greffe et vérifier si les patients en rechute ont une fréquence d’expression plus élevée. Ces expériences seront poursuivies aux sessions d’automne 2012 et d’hiver 2013 dans le cadre d’un stage « Honor ». Si une corrélation entre la fréquence d’expression et la rechute était démontrée, nous pourrions envisager une immunothérapie (à base d’anticorps bloquant les récepteurs) afin de prévenir la rechute chez les patients leucémiques ayant reçu une TSCO. L’association de récepteurs inhibiteurs à la rechute pourrait mener à une immunothérapie préventive chez les patients leucémiques ayant reçu une TSCO