LE DICHROISME CIRCULAIRE

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1 LE DICHROISME CIRCULAIRE
UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE Faculté de Pharmacie Chimie Organique - EA3901-DMAG-INERIS J. Pêcher, P. Sonnet, F.Y. Dupradeau LE DICHROISME CIRCULAIRE 25 novembre 2005

2 plan Qu’est-ce que la lumière polarisée Le dichroïsme circulaire
Conditions opératoires Exemples Avantages du dichroïsme circulaire

3 1) Qu’est-ce que la lumière polarisée
Une source émet un très grand nombre de photons. Les différents vecteurs vibrations de ces photons peuvent prendre toutes les orientations possibles dans chaque section droite du faisceau émis : la lumière est dite naturelle La lumière naturelle possède une symétrie de révolution autour de la direction de propagation La réflexion de la lumière à l’aide d’un miroir a fait perdre à la lumière sa symétrie de révolution. Alors la lumière réfléchie n’est plus de la lumière naturelle : elle est dite polarisée La lumière polarisée peut se séparer en deux composante : la lumière polarisée circulairement vers la droite la lumière polarisée circulairement vers la gauche

4 + la lumière polarisée circulairement vers la gauche
la lumière polarisée circulairement vers la droite Superposition de ces 2 composantes de même amplitude  lumière polarisée circulaire

5 Cas où la lumière polarisée circulaire est absorbé : dichroïsme circulaire

6 2) Le dichroïsme circulaire
Spectropolarimètre de dichroïsme circulaire LS : source lumineuse P1 et P2 : prismes M0  M5 : miroirs S1  S3 : fentes L : lentille F : filtre CDM : modulateur SH : cuve avec échantillon

7 Les structures secondaires n’absorbent pas de façon égale la lumière polarisée circulaire gauche et la lumière polarisée circulaire droite. L’absorption préférentielle de l’une de ces polarisations résulte en une déviation de la résultante. La mesure de cette déviation est appelée DICHROISME CIRCULAIRE

8 1 - bande positive  L absorbe plus que R
2 – bande négative  R absorbe plus que L 3 – rien  chromophore achiral ΔА = (AL – AR) εL coefficient d’extinction molaire de la LPG L*mol-1*cm-1 εR coefficient d’extinction molaire de la LPD L*mol-1*cm-1 ΔА = (εL – εR) * C * l Δε ΔА C * l = = (εL – εR) Δε L*mol-1*cm-1

9 Ellipticité molaire par résidu deg*cm2*dmol-1
Unités utilisés en DC Ellipticité molaire deg*cm2*dmol-1 C = concentration protéine en mol/L l = trajet optique dans la cuve en cm [θ] (2,303* ΔА *180) 4π 100 C * l * = deg cm2*dmol-1 3298 Δε (2,303* ΔА *180) 1 [θ] = MRW Ellipticité molaire par résidu deg*cm2*dmol-1 * * 4π 10*C * l deg cm2*dmol-1 M = masse de la protéine en Da N = nombre d’aminoacides C = concentration protéine en g/ml l = trajet optique dans la cuve en cm MRW M N-1 =

10 Le dichroïsme circulaire est utilisé pour étudier la structure des :
Protéines Sucres ADN Molécules chirales telles que cofacteur (pyridoxal-5’-phosphate), des flavines,des tri terpènes (acide ursolique), les hèmes,les flavocytochrome, des pigments photosynthètiques etc …

11 - Détermination du contenu en structure secondaire de protéine
Deux régions spectrales intéressantes pour obtenir des informations structurales : UV lointain 180 nm à 250 nm : - Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule - Détermination du contenu en structure secondaire de protéine - Effet de ligands sur la structure - Etudes d’interactions protéine-protéine et acides nucléiques-protéines - Etudes dynamiques (dénaturation, renaturation) 2) UV proche 250 nm à 350 nm : - Empreinte digitale de la structure tertiaire - Effet de ligands sur la structure - Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule

12 1) UV lointain 180 nm à 250 nm : chromophore liaison peptidique
Structure Aléatoire - bande négative à 195 nm transition n->π* - bande positive à 212 nm transition π->π* Feuillet β - bande positive à 196 nm transition n->π* - bande négative à 218 nm transition π->π* Hélice α - bande positive à 192 nm transition π->π* - bande négative à 209 nm transition π->π* - bande négative à 222 nm transition n->π* Hélice polyproline II - bande négative à 192 nm transition n->π - bande positive à 220 nm transition π->π* n ->π* électrons de non liaison de l’N du C du carbonyle π->π* électrons π du carbonyle L’intensité et l’énergie de transition dépendent des angles Φ et ψ  des structures secondaires

13 Hélice α Feuillet β Coude β Hélice PP II (collagène) Aléatoire spectres caractéristiques des différentes structures secondaires

14 θ  = fα* θα+ fβ* θβ + fp* θp
- Il est possible de déterminer, à partir d’un spectre DC en UV lointain, le pourcentage de structure secondaire présentes dans une protéine. - Il n’est pas possible de préciser la localisation de ces structures secondaires. - Pour déterminer le pourcentage de structures secondaires il fut considéré le signal DC comme étant la somme des contributions de différentes structures secondaires : θ  = fα* θα+ fβ* θβ + fp* θp θ  = Σi fi* θi Où fi est la fraction molaire de la structure secondaire i dans la protéine et θi est le signal DC pour un échantillons 100% i à la longueur d’onde . Différents logiciels effectuent cette deconvolution : CCA, CONTIN, CDSSTR, K2D, LINCOMB, SELCON, VARSLC, XLSSTR

15 - thermique Etudier la dénaturation: Détermination du Tm
Détermination de l’enthalpie ΔH Détermination de l’entropie ΔS ΔG = ΔH -TΔS A Tm, on a K=1 ΔG=0 et ΔS= ΔH/Tm ΔG = nRTlnK Courbe de l’équilibre thermique de 4 peptides GPO (-), GPA (- -),GPL(---), GAL(.)

16 2) UV proche 250 nm à 350 nm : chromophore chaîne latérale des acides aminés aromatiques et pont disulfure Phénylalanine Tyrosine Maximum d’absorbance à 276 nm et un épaulement à 283 nm Maximum d’absorbance à 254, 256, 262 et 267 nm Spectre de la II dehydroquinase et de son mutant R23Q Tryptophane Cystine Large bande entre 250 et 300 nm bande intense centrée sur 282 nm

17 3) Conditions opératoire :
Détermination de la concentration exacte de la molécule a étudié : méthode colorimétrique (biuret, Folin-lowry, Bradford …) A280nm lecture directe (avantage non destructif) Calibration du spectropolarimètre suivant la région spectrale étudiée Choix de la cuve (trajet optique) : 1 mm, 0.1 mm, 0.5 mm, mm Choix de la région spectrale (UV lointain ou UV proche) Faible concentration µmol.L-1

18 4) Exemples Exemple de la myoglobine
bande négative à 208 nm et à 222 nm  caractéristique de l’hélice α Deconvolution et obtention du pourcentage de structure secondaire Structure en % Hélice α Feuillet β Coude β Aléatoire myoglobine 75 5 9 Spectre DC de la myoglobine

19 Exemple de deux peptides
TPRO bande négative198 nm transition n->π* bande positive 228 nm transition π ->π* THYP bande négative199 nm transition n->π* bande positive 220 nm transition π ->π* Spectres DC de 2 peptides (Tpro et Thyp) % hélice α % feuillet β % coude β % aléatoire TPRO 2 36,5 25,3 35,6 THYP 1,5 38 34,7

20 Exemple trois peptides gpp3, gpp5 et scramble
Spectres DC de 3 peptides (gpp3, gpp5 et scramble) gpp3 bande négative198 nm transition n->π* bande positive 228 nm transition π ->π* gpp5 bande négative 200 nm transition n->π* bande positive 227 nm transition π ->π* scramble bande négative 200 nm transition n->π* bande positive 226 nm transition π ->π* Structure caractéristique de l’hélice polyproline 2

21 Dénaturation thermique
Courbe de l’équilibre thermique de 3 peptides (gpp3, gpp5 et scramble) F = (θobs - θF) / (θU - θF) Où θobs est l’ellipticité observé, θF est l’ellipticité du peptide replié et θU l’ellipticité dans l’état déplié. Le Tm est la température pour laquelle 50 % de triple hélice est encore présente dans le peptide max en nm Tm en °C GPP3 228 37,3 GPP5 227 39,7 scramble 226 47,3

22 5) Les avantages du dichroïsme circulaire
.On travaille en solution diluée .Des quantités de produit faibles (quelques dizaines de µg) .Pas de limite de taille .Mesures rapides et simples .Mesures cinétiques à des temps très courts

23 Bibliographie S.M Kelly et Al, Biochimica et biophysica acta, 2005, 1751, N.K Shah et Al, Biochemistry, 1996, 35,