Digital Droplet PCR pour la quantification rapide de l’ADN d’un donneur dans la circulation de receveurs transplantés en tant que potentiel biomarqueur.

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1 Digital Droplet PCR pour la quantification rapide de l’ADN d’un donneur dans la circulation de receveurs transplantés en tant que potentiel biomarqueur universel d’une lésion au niveau du greffon J. Beck, S. Bierau, S. Balzer, R. Andag, P. Kanzow, J. Schmitz, J. Gaedcke, O. Moerer, J.E. Slotta, P. Walson, O. Kollmar, M. Oellerich et E. Schütz Décembre 2013 © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

2 Introduction ADN acellulaire dérivé du greffon (GcfDNA)
Libéré par les cellules du greffon apoptotiques. Faibles pourcentages de la population de cfDNA total. Pourcentages accrus détectés lors d’un rejet (1). Des méthodes de quantification sensibles sont nécessaires. Séquençage de nouvelle génération possible (1). Inconvénients : Temps d’exécution long et coûts élevés. Les méthodes décrites nécessitent un ADN génomique du donneur/greffon. Snyder TM, Khush KK, Valantine HA, Quake SR. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:6229–34.

3 Introduction Digital Droplet PCR
Quantification absolue précise de molécules matricielles par séparation des molécules cibles et des statistiques de comptage. Quantification de GcfDNA par Digital Droplet PCR Utilisation de SNP avec des allèles hétérologues du donneur et du receveur. Panel présélectionné avec des fréquences alléliques mineures >0,4 ⇒ la plus grande probabilité d’avoir un état d’allèles hétérologues.

4 Question 1 Quelle est la probabilité qu’un SNP (fréquence allélique de la population = 0,5) soit AA/BB or AA/AB dans des combinaisons receveur/donneur non apparentés ?

5 Matériel et méthodes Extraction & préamplification de cfDNA Brevets
8 brevets ont été publiés suite à une greffe hépatique (LTx). Patients en ambulatoire stables : n=10 LTx, n=8 greffe cardiaque (HTx), n=9 greffe rénale (KTx). Extraction & préamplification de cfDNA Le cfDNA a été extrait à partir de 1 ml de plasma ( d’équivalents génomiques). Préamplification en utilisant le kit NEBNext Ultra DNA Library Prep (New England Biolabs). Digital Droplet PCR Utilisation du système QX100 ddPCR (Bio-Rad) selon les instructions du vendeur. ADN introduit : 30 – 100 ng.

6 Question 2 Pourquoi la pré-amplification de cfDNA est-elle nécessaire ?

7 Principaux résultats Caractéristiques de performance des dosages par ddPCR Imprecision intradosage : VC <15% (plage 4–14%) pour une teneur en allèle mineure de 2%, déterminée pour 13 dosages d’une série de 9 répétitions pour 1 analyse. Récupération : 1,87% (94% de la valeur dopée) sur 13 dosages de SNP, avec un ET de 0,24% (13%).

8 Résultats principaux : Evaluation du biais de pré-amplification
Figure 3. Résultats des bibliothèques de cfDNA préamplifié et de la détection directe, présentés sous forme de rapport du résultat d’échantillons pré-amplifiés à la mesure de l'ADN génomique ou de cfDNA direct à partir du même prélèvement sanguin. On peut observer que la pré-amplification n'a pas introduit un biais dans la méthode de détection de SNP. Les ratios des rapports de nombre de copies ainsi que les ET sont donnés.

9 Principaux résultats : Diagramme de sélection du dosage
Figure 3. La première étape de criblage utilise une PCR en temps réel et l'ADN génomique du receveur. Tous les SNP avec des génotypes hétérozygotes chez le receveur sont éliminés. L'étape de sélection qui suit utilise la ddPCR et le cfDNA préamplifié comme matrice ; ici le dosage informatif final pour le patient est défini. Un dosage informatif détecte un SNP homozygote chez le receveur et le greffon possède au moins un allèle hétérologue. Les pourcentages et les nombres sont calculés pour une fréquence allélique mineure de 0,5 et peuvent varier d’un patient à l’autre.

10 Main Results cfDNA du greffon dans les échantillons cliniques
Pourcentage de GcfDNA chez des patients stables < 10%. LTx : 3,5% en moyenne (1,0% - 8,5%). KTx : 1,2% en moyenne (0,2% - 3,5%). HTx : 0,9% en moyenne (0,1% - 3,4%). Les taux plus élevés de LTx reflètent un volume de greffon plus important et un taux de régénération des hépatocytes plus élevé. Quantités très importantes (∼90%) dans les échantillons prélevés juste après la reperfusion. Taux de GcfDNA chez les patients sans complication stables (< 15%) après 10 jours.

11 GcfDNA de patients stables
Figure 4. GcfDNA dans la circulation de 9 patients KTx stables, 8 patients TCx stables et 10 patients TFx stables (moyenne et ET donnés). Le nombre de dosages de SNP par ddPCR utilisés pour chaque patient est donné au dessous de l’absisse.

12 Diminution de GcfDNA après la greffe
Figure 5. Variance de la configuration de diminution de GcfDNA observée chez 3 patients LTx au cours des premiers jours après la greffe. Dans 1 case, une diminution rapide a été observée, dans un autre une persistance initiale à des valeurs plus élevées a été observée, suivie d’une baisse brutale légèrement retardée, tandis que le troisième patient (LTx8) montrait une diminution stable, mais lente de GcfDNA.

13 Résultats principaux cfDNA du greffon pendant des épisodes de rejet et cholestase Patient avec rejet confirmé par biopsie au jour 43. le GcfDNA a diminué progressivement avec des pics marqués (jours 38 et 58). Patient avec rejet tardif confirmé par biopsie au jour 144. les taux de GcfDNA ont été mesurés au jour 145 et une augmentation (19%) a été observée. Patient avec épisode de cholestase. Augmentation non spécifique des biomarqueurs AST, GGT et bilirubine. GcfDNA reste dans une plage stable.

14 Evolution au cours du temps de GcfDNA pendant des évènements cliniques
Figure 6. La teneur en GcfDNA a augmenté de façon marquée et régulière à partir du jour 31, avec un pic initial d'environ 60% au jour 38. Pendant cette période, le biomarqueur classique AST était plus variable. (Notez que l'échelle des ordonnées pour GcfDNA est multipliée par 10 par rapport à la Figure 4.) (B) Evolution au cours du temps du patient LTx3 : un épisode de rejet aigu tardif a été diagnostiqué au jour 144 après l’intervention chirurgicale. Le pourcentage de GcfDNA était de 19 % au jour 145 et a fortement augmenté à 55 % au jour 151. (C) L’évolution tardive au cours du temps du patient LTx1 est représentée, notamment un épisode de cholestase. Il faut noter que GcfDNA n'a pas augmenté malgré des augmentations dans les tests hépatiques classiques.

15 Question 3 Quels sont les avantages à mesurer l’ADN dérivé du greffon comparativement à un test classique pour déterminer un dysfonctionnement du greffon chez les receveurs ayant reçu une greffe de foie ?

16 Conclusion Un nouveau test de lésion du greffon rentable basé sur une ddPCR automatisée avec un temps d’exécution adéquat le même jour a été développé. Le GcfDNA interroge directement l’intégrité d’un organe LE GcfDNA est obtenu à partir de sang simplement prélevé permettant une “biopsie liquide” plus fréquente Le test peut être utile pour le contrôle d’une thérapie immunosuppressive optimale Peut entraîner une réduction du risque de rejet chronique en conseillant une intervention plus rapide

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