DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

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1 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives) permet le conseil génétique diagnostic des femmes porteuses Diagnostic prénatal Diagnostic préimplantatoire Diagnostic prédictif

2 COMPLEXITE DU CHAMP D’APPLICATION
Très nombreuses maladies génétiques – très nombreux gènes Phénotypes parfois mal définis Anomalies spécifiques d’une maladie – Stratégies d’étude spécifiques Capacité de réponse d’un patient à une molécule thérapeutique : Phamacogénétique

3 Méthodes utilisées pour le diagnostic génotypique
DIAGNOSTIC DIRECT 1 – Recherche de mutations ponctuelles - mutation connue - screening d’un gène : séquençage, DHPLC, HRM 2 – Recherche d’amplifications de triplets 3 - Recherche de délétions DIAGNOSTIC INDIRECT

4 Dans un microtube : ADN à amplifier ou matrice : 50ng à 500ng les 2 amorces -dNTP -Taq Polymérase -tampon avec Mg++ Volume final : 20 l à 100 l Appareil : Thermocycler

5 1– recherche directe de la mutation déjà identifiée dans la famille
A – PCR - restriction

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7 B – ASO Allele specific oligonucleotide
1 - PCR + DOT BLOT (dépôt sur membrane) 2 - hybridation par oligosondes spécifiques de la séquence normale de la séquence mutée

8 ASO

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10 The line-probe assay (LiPA)
Biotinilated primer

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12 C – ARMS test ou allele specific PCR

13 - Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente
D – test OLA PEO : Penthaethylene oxide units marquage fluorescent FAM HEX TET La sonde commune peut être marquée avec un fluochrome différent dans les PCR multiplex - Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente

14 Oligonucleotide ligation assay OLA
Application de la technique OLA à la recherche des principales mutations du gène CFTR (mucoviscidose)

15 2 – recherche de mutations dans un gène : screening
Séquençage DHPLC HRM

16 Séquençage (vecteur) 4 mélanges sont préparés:
- le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase (vecteur)

17 L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence

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19 Séquenceur à plaques

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21 DHPLC Dans des conditions de dénaturation partielle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les homoduplexes et les hétéroduplexes.

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23 HRM Après PCR en présence d’un intercalant fluorescent
cette technique permet, en appliquant une montée en T° très progressive, de discriminer des variants. La dénaturation provoque la baisse de la fluorescence puis son extinction quand la dénaturation est complète. Chaque séquence a donc une courbe de fusion qui lui est propre. Une modification de cette courbe signale la présence d’une anomalie.

24 2 – Recherche d’amplifications de triplets
Exemple du X Fragile - par PCR Possibilité d’amplifier jusqu’à 80 répétitions Hommes - si > 80répétitions = pas de signal femmes – un seul signal = sujet homozygote ou sujet présentant une mutation complète

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26 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Par Southern blot EagI FMR1 (CGG)50 EagI FMR1
sonde EagI EcoRI EcoRI FMR1 (CGG)500 sonde

27 Coupure EcoRI + EagI et SOUTHERN BLOT
PM PM MT MT MUTE PREMUTE X INACTIF 5,2 kb NORMAL X INACTIF PREMUTE X ACTIF 2,8 kb NORMAL X ACTIF

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29 3- Recherche de délétions
2-1 Délétions de petite taille PCR simple ou multiplex Southern MLPA QMPSF 2-2 Délétions des télomères : MLPA 3-3 Délétions de grande taille : CGH array

30 - Par PCR

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32 Recherche de délétions par PCR multiplex
Exemple de la myopathie de Duchenne et de Becker

33 Diagnostic délétions : Myopathie de Duchenne

34 Détection de délétions par la technique de Southern

35 Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions
QMPSF Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments stabilization Forward primer Reverse primer stabilization tail+6FAM Target specific sequences tail Primer design Multiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions 1A 2A 1B 2B ZIC TGIF SIX SHH SHH Ctrl gene SHH SIX3 TGIF ZIC2 Control - Patient Control Patient Denaturation Target 1 fragment Target 2 fragment 1A 1B 2B 2A PCR Peak size normalization based on endogenous peak of control gene Visual analysis Fragment Analysis

36 MLPA (1) Multiplex Ligation dependant PCR Amplification
Primer X Target specific Stuffer Primer Y binding site sequences sequence binding site Probe design Synthetic oligonucleotide M13 derived oligonucleotide 1A 2A 1B 2B Control Patient Target 1 1A 1B Multiplex hybridization and ligation No ligation of mismatched probes 2A Target 2 2B Peak size normalization Ratio = R = duplication R = 1 normal R = 0.5 deletion PCR with universal primers X and Y No exponential amplification of non ligated probes X Y Patient peak Control peak Fragment Analysis

37 Délétions de grande taille CGH array

38 Délétion en 2q12.3 de 2,5 Mb

39 DIAGNOSTIC INDIRECT INDICATIONS
- gène localisé dans le génome mais non cloné gène connu, mais mutation non identifiée exemple de la myopathie : recherche des filles vectrices délétion non détectable chez les filles (sauf PCRq) PRINCIPE identification du chromosome porteur du gène muté à l’aide de marqueurs polymorphiques situés à proximité du gène - liaison génétique CONTRAINTES - disposer d’un enfant atteint risque de recombinaison

40 Liaison génétique A1 A3 B2 B4 Gène N Gène M C2 C3 D4 D1 A1 B4 Gène M C3 D4

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42 Marqueurs polymorphiques utilisés : microsatellites

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44 Allèle 1 Allèle 2 1 -2 1 -2 2 -2 1 -1

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