DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. CONFERENZA DI LANCIO, 24 MARZO 2014 UTILISATION.

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1 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. CONFERENZA DI LANCIO, 24 MARZO 2014 UTILISATION DE L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE POUR L’ASSAINISSEMENT VIRAL DE LA VIGNE BADRA BOUAMAMA-GZARA 1, ILHEM SELMI 2, HAMZA BEN MOHAMED, SAMIR CHEBIL 1 NAIMA MAHFOUDHI 2 1 : LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE MOLÉCULAIRE DES PLANTES,CENTRE DE BIOTECHNOLOGIE DE BORJ-CEDRIA 2: LABORATOIRE DE VIROLOGIE, INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE AGRONOMIQUE DE TUNISIE

2 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. INTÉRÊT DE LA CULTURE DE LA VIGNE EN TUNISIE Bidh Hamem RafRafBalta 1 El Biodh Razegui Khamri 2 Kahli Kerkennah Muscat RafRaf Marsaoui Sakasly Meski Tozeur Tounsi Tounsi Kerkennah

3 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. PROBLÉMATIQUE: TOUTES LES VIGNES AUTOCHTONES SONT INFECTÉES PAR LES VIRUS Mahfoudhi et al., 2014 (Tun. J. Plant Protection) GFLV, GFkV, GLaV1, 2, 3 Martelli, 2014 (J. Plant Pathology), Mahfoudhi et al., 1998 GVA, GVB, GRSPaV Mahfoudhi et al., 2014 (J. Plant Pathology) GVD

4 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. TECHNIQUES D’ASSAINISSEMENT CHEZ LA VIGNE TechniquesGénotypesVirus Taux de réussite Auteurs Embryogenèse somatique Müller-Thurgau Grignolino Bosco GVA GRSPaV GLRaV-1, -3 100% Gambino et al., 2006 Cryothérapie /culture d’apex électrothérapie /Culture d’apex BlackGVA 62% 40% Bayati et al., 2011 Thermothérapie in vitro/ culture d’apex Mantilaria Prevezaniko GLRaV-Pr GRSPaV 39.6%-92.45% Malioga et al., 2009 Chimiothérapie 2 variétés roumaines GFkV 100% Guta et al., 2014 Culture de méristème Thermothérapie in vivo/c. méristèmes Thermothérapie in vitro/ c. méristèmes Embryogenèse somatique 26 variétésGRSPaV 28.9% 23.6% 9.1% 100% Gribaudo et al., 2006 Thermothérapie in vivo Rèze 141 GLRaV-1 GVA GRSPaV 75% 43% 95% Reynard et Spring, 2013 Embryogenèse somatique Roobernet Rupestris du Lot GLRaV-1 GFLV 100% Goussard et al., 1991

5 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. QU’EST CE QUE L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE? cellule différenciée Cellule dédifférenciée Formation des embryons somatiques Perception du signal (paroi) Transduction du signal Remodelage de la chromatine Activation de gènes (SERK, LEA, deshy., division cel., maturation, protoderme, Fact transc. phyt.end) Acquisition de la polarité Formation du protoderme Développement des embryons somatiques Germination en somaplants pH, ca++, obscurité, temp. froid, blessure, phytohormones, source carboné Cellule embryogène

6 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. QUELLE EST L’UTILITÉ L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE? ∞ Intégration dans des programmes d’amélioration (tests clonaux ……) ∞ Programmes de transformation génétique ∞Induction de la variation somaclonale (variabilité génétique) ∞Extraction de métabolites secondaires (bioréacteurs) ∞ Éradication de virus

7 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ETUDE DES POTENTIALITÉS EMBRYOGÈNES CHEZ HUIT VARIÉTÉS DE VIGNE VARIÉTÉS ITALIENNES 1. INZOLIA 2. CATARRATO 3. ZIBIBBO 4. NERO D’AVALO VARIÉTÉS TUNISIENNES: 1. MUSCAT RAF-RAF 2. BELDI 3. KHAMRI 4. GUELB SERDOUK

8 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. CULTURE IN VITRO: MÉTHODOLOGIE EXPLANTS INFLORESCENTIELS: FLEURS ENTIÈRES ANTHÈRES STIGMATES OVAIRES OF Cap E Milieux utilisés: VV16: MS +88 mM saccharose + 5 µMNOA+ 4.4 µMBAP VV12: MS +88 mM saccharose + 10 µMNOA+ 4.4 µMBAP

9 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. RÉPONSES DES EXPLANTS INFLORESCENTIELS: VISUALISATION MORPHOLOGIQUE Cas des anthères Cas des ovaires Cas des inflorescences Cas des stigmates

10 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. EXPRESSION DES EMBRYONS SOMATIQUES Maturation des embryons somatiques: Globulaire Cordiforme Torpille Cotylédonaire

11 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. GERMINATION DES EMBRYONS SOMATIQUES Élongation Enracinement Développement des feuilles cotylédonaires

12 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ASSAINISSEMENT D’UNE VARIÉTÉ DE VIGNE LOCALE ‘HENCHA’ Évaluation de l’état virologique Régénération via l’embryogenèse somatique Evaluation de l’état sanitaire des somaplants

13 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ÉTAT VIROLOGIQUE DE LA VARIÉTÉ ‘HENCHA’ Test sérologiques: Boutures lignifiées DAS-ELISA (GLRa-V-1, 2, 3) (GFLV) (ArMV) (GFkV) TAS-ELISA GVA GVB RESULTATS Double infection virale: GVA, GFkV Extrait végétal

14 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ANALYSE MOLÉCULAIRE DE LA PLANTE MÈRE: RT-PCR Acides nucléiques totaux (TNA) Extraction: phloème (boutures lignifiées) Tampon guanidine (Foissac et al., 2001) RT-PCR: GVA, GRSPaV, GFkV Triple infection de la plante mère ‘Hencha’ RSP-H48: AGCTGGGATTATAAGGGAGGT RSP-C49: CCAGCCGTTCCACCACTAAT Lima et al., 2006 GRSPaV: 329 pb Minarfa et Hadidi GVA: 430 pb H587 (5´- GACAAATGGCACACTACG-3´) C995 (5´-AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG-3´) Présence du GSPaV Présence du GVA

15 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. RÉGÉNÉRATION D’UNE VARIÉTÉ DE VIGNE DE TABLE ‘HENCHA’ Bouturage fructifère ou forçage

16 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE À PARTIR DU FILAMENT CP4: Chée and Pool (1987)+ 2 mg/l 2,4-D+2.5 mg/l TDZ Matériel: Anthères immatures (stade H, Baggiollini)

17 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. VISUALISATION DES EMBRYONS SOMATIQUES PAR ESEM Embryons somatiques primaires issus de façon directe à partir du point d’attachement du filament

18 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. EXPRESSION DES EMBRYONS SOMATIQUES CHEZ LA VARIÉTÉ HENCHA

19 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. CONVERSION DES EMBRYONS SOMATIQUES EN SOMAPLANTS 1. Embryogenèse somatique seule: (sans traitement préalable). 2. Couplage (embryogenèse somatique/ thermothérapie in vitro):Traitement de 15 somaplants par un choc thermique in vitro (39°C/48h). Deux traitements:

20 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. LAVAGE DES SOMAPLANTS AVANT L’ACCLIMATATION

21 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. TRANSFERT DES SOMAPLANTS EN POTS

22 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. SOMAPLANTS APRÈS UN MOIS D’ACCLIMATATION Taux de reprise de 80%

23 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. CONSERVATION DES SOMAPLANTS DANS DES PHYTOTRONS

24 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ACCLIMATATION

25 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. ANALYSE DE 50 SOMAPLANTS ISSUS DE LA VARIÉTÉ ‘HENCHA’ Extraction du TNA tampon guanidine thiocynate (Foissac et al., 2001) Nervures principales issues de boutures herbacées ( 6 mois d’acclimatation) RT-PCR GRSPaV GVA GFkV en cours de réalisation

26 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. RÉSULTATS 100% des somaplants indemnes des virus GVA et GRSPaV 100% des somaplants issus embryogenèse couplées à la thermothérapie in vitro indemnes des virus GVA et GRSPaV

27 DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie 2007-2013. PERSPECTIVES Confirmer l’absence des particules virales au niveau des différents stades de développement de l’embryogenèse somatique par une étude ultrastructurale (TEM) Multiplication des têtes de clones assainis de la triple infection Évaluation de la conformité des somaplants (RAPD/ cyto. Flux, amélographie) Évaluer l’état sanitaire des somaplants issus des 8 variétés étudiées dans le cadre du projet