Numérations en microbiologie.

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1 Numérations en microbiologie.
titre Notions Théoriques Associées 07 TP 07

2 1. Les techniques de numération.
1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. 1.2. Numération en milieu solide: en surface. 1.3. Numération en milieu liquide. 2. Préparation d’une gamme de dilution. 2.1. Principe de la gamme. 2.2. Détermination de la « concentration » cible. 2.3. Détermination de la « concentration » de l’inoculum. 3. Exercices d’application. 3.1. Ensemencement dans la masse. 3.2. Ensemencement en surface. 3.3. Ensemencement en milieu liquide. 3.4. Compilation.

3 1.1 1. Les techniques de numération.
1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. 1.1 La première étape d’une numération est la préparation d’une gamme de dilution. Cette gamme dépend de la technique utilisée. On verra sa méthode de réalisation en dernier. PRINCIPE : On ensemence un milieu gélosé avec un échantillon de suspension bactérienne. On incube 24 h. On compte les colonies présentes dans la gélose. 1 bactérie se développe en donnant 1 colonie. On n’est pas sûr qu’une seule bactérie suffise. Peut-être qu’il faut qu’elles soient plusieurs. On parle d’UFC (Unité Formant Colonie) ENSEMENCEMENT : On n’est jamais sûr de la quantité de microorganismes ensemencée. C’est pourquoi, on a l’habitude d’encadrer la dilution (appelée dilution cible) théoriquement la meilleure, par une dilution supérieure et une inférieure. Retour plan

4 1.1 N / V UFC. mL-1 1. Les techniques de numération.
1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. 1.1 La première étape des numération est la préparation d’une gamme de dilution. Cette gamme dépend de la technique utilisée. On verra sa méthode de réalisation en dernier. PRINCIPE : On ensemence un milieu gélosé avec un échantillon de suspension bactérienne. On incube 24 h. On compte les colonies présentes dans la gélose. 1 bactérie se développe en donnant 1 colonie. On n’est pas sûr qu’une seule bactérie suffise. Peut-être qu’il faut qu’elles soient plusieurs. On parle d’UFC (Unité Formant Colonie) CALCULS : On note le volume d’inoculum utilisé (ici V = 1 mL) On compte les colonies présentes dans la gélose ( N ). On en déduit le nombre de bactéries dans l’inoculum : N / V UFC. mL-1 Retour plan

5 Technique d’ensemencement. La surcouche empêche ce phénomène.
1. Les techniques de numération. 1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. 2 variantes: On verse l’inoculum ( 1 mL ) dans 9 mL de gélose en surfusion. 10-5 10-6 10-7 1.1 On mélange et on verse dans une boîte de Pétri. Technique d’ensemencement. On coule une surcouche. Les colonies qui se développent à la surface de la gélose s’étalent plus que les autres: elles présentent une apparence qui peut faire penser que la suspension possède plusieurs types de bactéries. La surcouche empêche ce phénomène. Retour plan

6 Comment choisir entre les deux ?
1. Les techniques de numération. 1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. 2 variantes: On verse l’inoculum ( 1 mL) dans la boîte de Pétri. 10-5 10-6 10-7 1.1 On verse la gélose en surfusion et on mélange doucement. Comment choisir entre les deux ? Technique d’ensemencement. On coule une surcouche. Personnellement, je préfère cette technique. L’inconvénient est que l’homogénéisation est plus délicate. L’avantage est qu’il est plus pratique de couler la surcouche car il suffit de garder un peu de gélose au fond du tube. Retour plan

7 1.1 1. Les techniques de numération.
1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. On compte les colonies. On analyse les résultats. 10-5 10-6 10-7 1.1 On ne tient compte que des boîtes contenant : 20 < N < 300 colonies 1500 203 24 N < 20 on considère que la boîte n’est pas statistiquement valable. N < 300 on estime que le manipulateur est susceptible de faire de nombreuses erreurs. trop 250 19 Retour plan

8 On prend comme référence la dilution la plus grande utilisée.
1. Les techniques de numération. On prend comme référence la dilution la plus grande utilisée. 1.1. Numération en milieu solide: dans la masse. On compte les colonies. On analyse les résultats. On vérifie la cohérence des résultats : - à dilution égale - à dilution différente 1.1 On calcule la moyenne. 10-5 10-6 10-7 Calculs. 1500 203 24 n = [( )/ ]/3 = 23,1 bact N = n = 23,1 = 23, bact.mL-1 V x D 1 x 10-7 trop 250 19 Retour plan

9 Technique d’ensemencement.
1. Les techniques de numération. 1.2. Numération en milieu solide: en surface. On dépose l’inoculum ( 0,1 mL) sur la gélose d’une boîte de Pétri. 10-6 10-7 10-8 On étale au râteau ou avec des billes. 1.2 Technique d’ensemencement. Retour plan

10 1.2 1. Les techniques de numération.
1.2. Numération en milieu solide: en surface. On compte les colonies. On analyse les résultats. On calcule la moyenne. 10-5 10-6 10-7 1.2 Calculs. 217 21 5 n = [( )/10 + ( )]/4 = 23,1 bact N = n = 23,1 = 23, bact.mL-1 V x D 0,1 x 10-6 220 24 5 Retour plan

11 On encadre avec deux dilutions.
1. Les techniques de numération. On encadre avec deux dilutions. 1.3. Numération en milieu liquide. 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 1.3 Technique d’ensemencement. Retour plan

12 On prend comme référence la dilution du premier des trois tubes.
1. Les techniques de numération. 1.3. Numération en milieu liquide. On note le code. On consulte Mc Grady. On calcule la concentration. 1.3 N = n / D = bact.mL-1 N = n / D = 1, bact.mL-1 Calculs On prend comme référence la dilution du premier des trois tubes. Mac Grady : NPP = 15 Mac G15dy : NPP = 1,5 Retour plan

13 La première étape est de diluer la suspension.
2. Préparation d’une gamme de dilution. 2.1. Principe de la gamme. Un inoculum microbien contient des milliards de cellules. Or, les techniques de numération nécessitent des suspensions de quelques centaines ou milliers de cellules. La première étape est de diluer la suspension. 2.1 Pour choisir la dilution cible, il faut connaître: La « concentration » de départ (l’inoculum). La « concentration » finale (cible). On n’a théoriquement pas le droit de parler de concentration pour une suspension. Ce terme est réservé aux solution. Dcible = Ccible Cinoculum Retour plan

14 2.2 2. Préparation d’une gamme de dilution.
2.2. Détermination de la « concentration » cible. Le nombre de germes dépend uniquement de la technique utilisée. Numération dans la masse. 1 mL de suspension doit contenir environ 150 bactéries 2.2 Ccible = N / V = 150 / 1 = 150 bact.mL-1 Numération en surface. 0,1 mL de suspension doit contenir environ 150 bactéries Ccible = N / V = 150 / 0,1 = 1500 bact.mL-1 Numération en milieu liquide. 1 mL de suspension doit contenir environ 1 bactérie Ccible = N / V = 1 / 1 = 1 bact.mL-1 Retour plan

15 Il existe plusieurs méthodes d’évaluation.
2. Préparation d’une gamme de dilution. 2.3. Détermination de la « concentration » de l’inoculum. Difficile d’évaluer la « concentration » initiale alors que c’est elle que l’on cherche à déterminer. Il existe plusieurs méthodes d’évaluation. 2.3 Mac Farland Il s’agit de tubes dont les troubles ont été calibrés. On compare l’inoculum aux tubes de la gamme. 0,5 1 2 3 bact.mL-1 bact.mL-1 bact.mL-1 bact.mL-1 Retour plan

16 Il existe plusieurs méthodes d’évaluation.
2. Préparation d’une gamme de dilution. Retour plan 2.3. Détermination de la « concentration » de l’inoculum. Difficile d’évaluer la « concentration » initiale alors que c’est elle que l’on cherche à déterminer. Il existe plusieurs méthodes d’évaluation. 2.3 Cellule de Malassez Il s’agit d’une lame de microscope où est gravé une grille d’une surface connue. Le nombre de cellules comptées correspond à un volume de suspension de 1 µL. 1 µL

17 Il existe plusieurs méthodes d’évaluation.
2. Préparation d’une gamme de dilution. Retour plan 2.3. Détermination de la « concentration » de l’inoculum. Difficile d’évaluer la « concentration » initiale alors que c’est elle que l’on cherche à déterminer. Il existe plusieurs méthodes d’évaluation. Cette méthode n’est pas adaptée à des cellules de la taille des bactéries. On l’utilise pour la numération des levures et des cellules constitutives du sang (globules rouges et leucocytes). De plus, tout comptage de cellules mobiles est impossible. 2.3 Cellule de Malassez 1 µL

18 2.3 2. Préparation d’une gamme de dilution.
2.3. Détermination de la « concentration » de l’inoculum. Difficile d’évaluer la « concentration » initiale alors que c’est elle que l’on cherche à déterminer. Il existe plusieurs méthodes d’évaluation. 2.3 Mesure du trouble au spectromètre. C’est un dérivé de la méthode de Mac Farland. On étalonne l’appareil avec des suspension de teneur connue et on évalue le trouble des inoculum. Quelques relations de proportionnalité : 1 UA à 550 nm (Unité d’absorbance) --> UFC/mL ENTEROBACTERIACEAE (en général): E coli : 1,2.109 Bacillus : 4,4.107 Lactobacillus :1,8.108 Staphylococcus : 5,8.108 (si Abs à 600 nm : ) C’est une méthode simple et rapide mais pas forcément très précise. Heureusement que l’on encadre la valeur cible ! Par contre, cette technique n’est utilisable que pour des concentrations relativement importantes de microorganismes. Pour les levures :7.106 lev.mL-1 Retour plan

19 2.3 2. Préparation d’une gamme de dilution.
La dilution cible est obtenue par dilution sériée d’ordre 10. 2.3. Réalisation de la gamme. 1 mL est versé dans 9 mL (d = 1/10). La solution obtenue est à nouveau diluée au 1/10, etc. 2.3 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Retour plan

20 3.1.1 3. Exercices d’application. 3.1. Ensemencement dans la masse.
Le trouble de cet inoculum est voisin du tube 5 de Mac Farland. Enoncé. On veut dénombrer un inoculum par la méthode d’ensemencement dans la masse. Calculer la dilution cible 3.1.1 On compte sur les boîtes: Dcible -1 Dcible Dcible+1 215 22 3 230 30 31 Analyser les résultats. Déterminer le nombre de bactéries par mL d’inoculum. Retour plan

21 3.2.1 3. Exercices d’application. 3.2. Ensemencement en surface.
Le trouble de cet inoculum est voisin du tube 3 de Mac Farland. Enoncé. On veut dénombrer un inoculum par la méthode d’ensemencement en surface. Calculer la dilution cible 3.2.1 On compte sur les boîtes: Dcible -1 Dcible Dcible+1 > 300 132 12 90 15 Analyser les résultats. Déterminer le nombre de bactéries par mL d’inoculum. Retour plan

22 3.3.1 3. Exercices d’application.
3.3. Ensemencement en milieu liquide. Le trouble de cet inoculum dilué au 1/20 est voisin du tube 2 de Mac Farland. Enoncé. On veut dénombrer un inoculum par la méthode d’ensemencement en milieu liquide. Calculer la dilution cible 3.3.1 On note le trouble des tubes: Dcible-2 Dcible -1 Dcible Dcible+1 Dcible+2 + + + + - + - - - Analyser les résultats. Déterminer le nombre de bactéries par mL d’inoculum. Retour plan

23 3.4.1 3. Exercices d’application. 3.4. Compilation. 3.4.1. Enoncé.
Le trouble de cet inoculum dilué au 1/500 est voisin du tube 0,5 de Mac Farland. Enoncé. On veut dénombrer un inoculum par les trois méthode d’ensemencement. Dans la masse Dcible -1 Dcible Dcible +1 >300 220 46 208 24 Calculer les trois dilutions cibles 3.4.1 Etablir la gamme de dilutions adaptée En surface Dcible -1 Dcible Dcible +1 > 300 280 31 250 13 On obtient les résultats suivants: Analyser les résultats. Déterminer le nombre de bactéries par mL d’inoculum. En milieu liquide Dcible -2 Dcible -1 Dcible Dcible +1 Dcible +2 3 2