La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

GENOME COURS I.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "GENOME COURS I."— Transcription de la présentation:

1 GENOME COURS I

2 UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D’ ETUDE DU GENOME

3 I- STRUCTURE DU GENOME Organisation Composition
Les différentes séquences Le gène

4 INTRODUCTION Ensemble du matériel génétique d’un organisme
Il est constitué d’ADN pour la majorité des organismes Certains virus ont un génome constitué d‘ARN La taille du génome varie en fonction des espèces

5 ORGANISATION Chez la majorité des bactéries ( procaryotes) le génome est contenu dans UN seul chromosome circulaire Le génome peut être linéaire (actinomycètes) Chez les eucaryotes : ADN nucléaire , ADN mitochondrial

6 DENSITE DES GENOMES Chez E.Coli , le génome est composé presque exclusivement de gènes 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb Chez l’Homme 3200 Mégabases / Gènes / 8 / MGB La quasi-totalité génome bactérien est codant !

7 Espèce Humaine Génome nucléaire: 3,2 109 pb pour n chromosomes et répartis dans 22 autosomes + 2 chromosomes sexuels Génome mitochondrial : pb, épisome Aucune corrélation entre la taille du génome et la complexité des organismes Plus grands génomes : > pb : pins, plantes

8 COMPOSITION DU GENOME HUMAIN
Des gènes : environ composés de séquences codantes ( exons) et non codantes (les introns, séquences régulatrices; promoteur, silencer, enhancer …) régions codantes : 1.5% du génome ; introns 25%, région régulatrices: 5% Des Pseudogènes 1.5% De très nombreuses séquences répétèes 60% Autres régions non codantes : séquences uniques ou très peu répétées 7%

9 Séquences répétées Répétées en Tandem
minisatellites : des séquences de 10 à 25 pb sont répétées un grand nombre de fois ( empreintes génétiques) microsatellites : 1à 5 pb répétées x fois sur plusieurs kb ADN satellite : centromères , télomères ( 10% du génome humain)

10 Les plus étudiés (CG; CA)n
Microsatellites Dispersés sur tout le génome 1 à 5 nucléotides Copies A(n) / T(n) (CG)n / (CA)n/ (GT)n  106 (CT)n / (GA)n x 106 Les plus étudiés (CG; CA)n CG n = 23 n = 20 n = 15 CGCGCGCG TANDEM

11 Séquences répétées dispersées
Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu) Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases ( copies) Les transposons ( copies)

12 Séquences répétés dispersées
SINEs : Famille ALU Copies : 7  105 pb pb 104 pb ALU ALU Famille Kpn (L1) 1300 pb copies 6  104 Peuvent être transcrites

13 Séquences SINEs ALU REPEAT 120 135 290 (AAA)n AT RICH GC RICH GC RICH

14 Eléments transposables
IS éléments 2600 – 700 pb 5'  3' CTGACTT 3'  5' TTCAGTC Répétition aux extrêmités (Maïs)

15 Gène Séquence d'acides nucléiques contenant une information codée, transmissible, pour la production régulée d'un ARN (transcription), ce dernier pouvant être traduit en une chaîne polypeptique Certains gènes codent seulement des ARN sans traduction en protéine

16 Les gènes des rétrovirus sont constitués d'ARN

17 Pseudogènes Séquences partiellement homologues aux gènes qui ne donnent jamais de protéines correspondantes  Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté  Soit des ARN  retro-transcrit  ADN  intégration ADN génomique ( transposition)

18 ANATOMIE DU GENE b globine

19 1 30 31 104 105 146 IVS1 IVS2 Gène b globine 1600 pb Exon I Exon II
Zone des promoteurs 5' UTR 3' UTR 1 30 31 104 105 146 Exon I IVS1 Exon II IVS2 Exon III Gène b globine 1600 pb

20 Région régulatrice en 5' Zone des promoteurs
Facteurs de transcription -105 -100 -80 -70 CAP CACCC CACCC CCAAT TATA A/T A A/T A G G CCCCC Site d'initiation de la transcription

21 Région 5' non Traduite 5' UTR
CAP Codon initiateur CACCATG +50 CTTCTG Région 5' UTR - Attachement aux ribosomes - Régulation transcription +/-

22 Exon Partie codante d'un gène  protéine Exon 1 ATG IVS1 30
Exons  Traduction  protéine

23 Zone non traduite IVS1 130 pb Exon 2 GT Donneur de l'épissage AG
Accepteur de l'épissage

24 Région 3' UTR Codon 147 146 AATAAA STOP 20 AAAAAA 132 Nucléotides
AATAAA : Signal de polyadénylation : Clivage de l'ARN après transcription (AAAAA)n : Stabilise l'ARN ( ajouté après la transcription)

25 II ETUDE DU GENOME A- Les expériences fondamentales qui ont révélé l’ existence de l’ADN comme Génome L’ Etude du génome complet d’un individu est très récente et découle du séquençage d’un génome entier ( début XXI)

26 C’est l’analyse de l‘ADN
Elle était indirecte avant l’invention des techniques du séquençage (1977) Elle utilisait l’étude des protéines qui renseignaient indirectement sur les gènes Des mutants de bactéries , de drosophiles

27 Origines de l’étude du Génome
Dès le XIX siècle : l’étude de la transmission des caractères sur des critères d’analyses qualitatives et statistiques ( Lois de Mendel 1860) Mise en évidence de l ’ADN (1865) Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile) critères d’analyses qualitatives et statistiques Puis des techniques bactériologiques et biochimiques ont permis de franchir une étape dans le degré d’investigation de l’étude des génomes ( ) Structure ADN (1953 )

28 Expérience de Griffith (1928)
Bactérie : Diplococcus pneumoniae 2 souches S = capsule polysaccharidique > infectieux R = dépourvue de capsule > non infectieux

29 Des lots de souris Groupe1 : Injection souche S à des souris > pneumonie Groupe 2 : Injection souche R > pas d’infection Groupe 3 : Injection d’une souche R + souche S préalablement tuée par la chaleur => pneumonie

30 RESULTAT Le sang des souris du groupe 3 est mis en culture : on recueille soit des souches R soit des souches S virulentes ... L’expérience fût refaite en 1944 avec la conclusion que l’ADN était le matériel héréditaire

31 Avery, Mac Leod, Mac Carthy
Interprétation : Les souches S tuées sont capables d’induire une transformation des bactéries R en bactéries S Quelle est la nature de ce matériel transmissible ? En ajoutant l’ ADN purifié des souches S à des colonies de type R les colonies R > S Les autres fractions (polysaccharides,protéines) n’ont pas de pouvoir transformant...

32 Lorsque l’ADN des souches S est traité par la DNAse avant d’être ajouté aux bactéries de souche R > pas de bactérie de type S La transformation des souches R en souche S est la conséquence d’un transfert d’ADN L’ADN est donc le matériel génétique

33 33

34 De 1944 à 1952 une partie de la communauté scientifique n’était toujours pas convaincue par cette conclusion et l’hypothèse que les protéines étaient le matériel héréditaire était encore défendue

35 Colette VENDRELY ( professeur d’embryologie à Amiens ) & R
Colette VENDRELY ( professeur d’embryologie à Amiens ) & R. VENDRELY démontrent en 1949 que la quantité d‘ADN présente dans les gamètes est la moitié de celle contenue dans les cellules somatiques. Ce résultat est le seul travail français internationalement cité comme contribution majeure à la preuve de l’ADN comme matériel héréditaire

36 UN pas décisif vers la découverte de la structure de l ’ADN
En 1950 Erwin Chargaff découvre que l'adénine et la thymine existent en quantités égales, et qu'il en est de même de la guanine et de la cytosine, d'où la célèbre équation % A = % T % G = % C

37 Expérience Hershey & Chase
1952, ils démontrent en utilisant le phage T2 traité au tritium * (acides nucléiques radio-actifs) que les ADNs répliqués sont radioactifs. Les protéines ne sont pas radioactives donc ne se répliquent pas …

38 Découverte de la structure de l’ADN 1953

39 39

40 Découverte de la structure de l’ADN
40

41

42 “ It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material ” . « Il n’ a pas échappé à notre attention que la les appariements spécifiques que nous proposons suppose immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique  » Le modèle de réplication semi-conservatif sera prouvé en 1958 par Meselson et Stalh

43 Le modèle semi conservatif de la réplication
Le bon modèle pour 3 possibilités

44 modèle conservatif A partir d'une molécule d'ADN bicaténaire "mère", on forme une nouvelle molécule d'ADN bicaténaire. On garde donc ici une molécule "mère", non modifiée (elle est donc conservée), tout en "créant" une nouvelle molécule ("fille").

45 On ne conserve aucun brin intact
On ne conserve aucun brin intact. La copie se réalise par fragments dispersés dans l'ensemble de l'ADN, permettant de former les deux molécules d'ADN bicaténaires "filles".

46 Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN bicaténaire "mère"
Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN bicaténaire "mère". Chaque brin sert donc de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, l'ensemble reformant une molécule d'ADN bicaténaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule mère

47 Dans le tube 0 la totalité de l’ADN est marqué à l’ azote 15
( les 2 brins) . Après une réplication la moitié de l’ADN est radio actif . Au fur et à mesure des réplications la quantité d’ADN marqué diminue l’ADN au profit d’abord d’ ADN hybride , puis d’ADN froid.

48 Le résultat observé après séparation des ADNs répliqué correspond au modèle semi conservatif

49 Propriétés physico-chimiques
Déroulement de tout l’ ADN d’une cellule d’un individu : 1.6 Mètre Déroulement de l’ADN de toutes les cellules d’un individu : diamètre du système solaire! ADN cellulaire : 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)

50 Quelques valeurs … Pb = Masse Moléculaire = 2x330 g x /6, moles de nucléotides > = 6, g d’ADN Il y a environ 6 picogrammes d’ADN dans une cellule diploide 1 µg d’ADN génomique -> 10-6 g / g/cellule >> 107 cellules diploides

51 II ETUDE DU GENOME B) LES OUTILS

52 B- 1- PURIFICATION DE l’ ADN Méthode au Phénol / Chloroforme
Purification des cellules Lyse des cellules ( SDS, Lysozyme) Action protéinase K, Rnase Extraction au phénol Action du CHCl3 Précipitation dans l’éthanol en milieu salin Re-suspension en présence de tampon TRIS - EDTA ( 1 mM) ( 100 microG / microl)

53

54

55 B-2 Les Enzymes de Restriction
Sont des ciseaux moléculaires qui hydrolysent l’ADN; Ils reconnaissent des séquences palindromiques (Ex RADAR) Ils permettent de mette en évidence des variations de séquence ( polymorphismes, mutations) Ils sont utilisés en génie génétique ( clonage) En diagnostic de routine en génétique médicale

56 Des enzymes de Restriction

57 5'-G*GATCC-3' Bam HI 3'-CCTAG* G-5’ 5 '-G -3' --- 5'- GATCC-3' 3'-CCTAG-5' ----> 3'- G-5'

58

59 B-3 L’ Hybridation et les sondes
Hybridation par complémentarité de séquence et appariement des bases Sonde : petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée par un composé fluorescent, ou radioactif Les sondes doivent être spécifiques d’une séquence et très sensibles. Utilisation diagnostique

60

61 S I M P L E B R N Cot (mole  sec .l-1) Rapide Lent 100
ADN hautement répétitif S I M P L E B R N % 60 ADN moyennement répétitif ADN peu répétitif 20 10-2 Copies uniques 10-3 100 101 102 104 Cot (mole  sec .l-1) Rapide Lent Taux de Renaturation

62 B-4 Application sondes et ER : "POLYMORPHISME" Plusieurs Formes
Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle soit ponctuelle ou qu'elle intéresse une répétition de mini / micro satellites est un polymorphisme si sa fréquence est  1 % dans une population donnée à une fréquence < 1 % mutation (privée) Les polymorphismes sont soit : - Neutres - Avantageux - Désavantageux

63 Les Polymorphismes L'ADN n'est pas un élément statique
Il est sujet à des modifications transmissibles Les variations de séquence sont appelées polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une fréquence > 0.01 (moins de 1 % : mutations) L'hétérozygotie moyenne de l'ADN humain est d'environ 0,004 (1 base différente toutes les bases entre 2 allèles ou 2 séquences, entre 2 individus)

64 Le polymorphisme affecte toutes les régions de l'ADN
- Séquences codantes - Introns - ADN répété (mini, microsat…) Il peut modifier : - 1- Un site de restriction - 2- La longueur d'un motif répété

65 Un polymorphisme peut induire une  longueur détectable par enzyme de restriction
Microsatellites Minisatellites

66 Les polymorphismes du DNA servent à son analyse

67 RFLP Un RFLP est défini par un couple : Sonde / Enzyme Sa localisation précise, sa variabilité et sa transmission mendélienne lui confèrent un caractère de marqueur génétique codominant. Le couple sonde / enzyme se caractérise par : + / - et correspond à un bi-allélisme Les RFLPs sont mis en évidence par la méthode de Southern ou PCR Pour être informatif : le RFLP doit être reconnu par une sonde unique

68 A B Exemple EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'
Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne peut plus hydrolyser l'ADN à cet endroit. A B GAGTTC CTCAAG (A + B)

69 On distingue des sites de restriction obligatoires (toujours présents) et des sites de restriction variables  Polymorphisme MSt II 1 2 3 4 5 Chez un individu sur 100 on découvre

70 Ces fragments peuvent être différencier par leur taille
Marqueur Position non connue avec précision Eco RI+ Gène 4kb Eco R1- Gène muté  maladie M 5kb Ces fragments peuvent être différencier par leur taille

71 Polymorphisme de Répétition
EcoRI EcoRI (CA)n Allèle A 200 pb EcoRI EcoRI + 2(CA)n Allèle B 300 pb sonde A/B A/A B/B 300 200


Télécharger ppt "GENOME COURS I."

Présentations similaires


Annonces Google