1 1Justesse des longueurs d’onde PARTIE 3a : Applications en UV Pour vérifier que l’appareil mesure les bonnes longueurs d’onde, on utilise idéalement.

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1 1 1Justesse des longueurs d’onde PARTIE 3a : Applications en UV Pour vérifier que l’appareil mesure les bonnes longueurs d’onde, on utilise idéalement un étalon avec plusieurs bandes fines à intervalle régulier. Étalons d’émission: Source de lumière interne qui produit des bandes étroites. Exemple : lampe au deutérium à 486 nm, 656 nm … Étalons d’absorption solides: Très stable (oxyde d’holmium). Étalons d’absorption liquides: Préparées quelques instants avant la mesure, concentration connue et précises.

2 2 1Justesse des longueurs d’onde

3 3 Recalage des longueurs d’onde (entre 2 mesures) En effectuant des mesures d’absorbance au lamda max on minimise l’erreur. Causé par des défauts de l’instrument.

4 4 2Justesse des absorbances Une même solution devrait toujours avoir la même A à un lamda donné. Étalon idéal

5 5 2Justesse des absorbances Vérification de la justesse des A avec une solution de K 2 Cr 2 O 7

6 6 3Choix du pH Au besoin on utilise un tampon qui n’absorbe pas dans la zone utilisée pour doser. Autres exemples : indicateurs acido-basiques (phénolphtaléine). Le pH peut changer la distribution des charges dans une molécule et modifier ainsi les niveaux d’énergie.

7 7 4Température Peut causer une expansion du solvant surtout organique (cellule fermée) ou une évaporation (cellule ouverte). Dans les 2 cas, la concentration est modifiée. Dénaturation de l’ADN sous l’effet de la chaleur: L’ADN absorbe beaucoup plus en UV sous forme déployée. Contrôle de la température de l’échantillon par une cellule Peltier.

8 8 5Photochimie Problème de fluorescence : certains échantillons sont fluorescents, c’est-à-dire qu’ils émettent de la lumière de longueur d’onde plus longue lorsqu’ils sont irradiés par une lumière de longueur d’onde plus courte. Cause une diminution de l’absorbance. Problème de décomposition de l’échantillon par des réactions chimiques engendrées par les photons. Solution : filtre pour enlever  causant la fluorescence. Filtre après l’échantillon pour couper les  créées par la fluorescence. Spectre incomplet

9 9 6Interférences Diffusion de la lumière par des particules en suspension (comme les excipients en pharmaceutique). Augmente l’absorbance car une partie de la lumière est déviée selon un angle et ne parvient pas au détecteur. Solutions: - filtrer l’échantillon - rapprocher l’échantillon du détecteur - apporter une correction Autres composés absorbants dans la même région que le composé cible.

10 10 7Techniques de correction : Référence interne Lorsqu’une interférence cause un décalage de la ligne de base entre les mesures. 1-On choisit un lamda sur la ligne de base près du pic et on détermine A. 2- On soustrait ce A au pic d’absorption.

11 11 8Techniques de correction : Correction en 3 points Pour soustraire l’absorbance interférante de fond. Aussi nommée Morton-Stubbs. Utilise 2 lamda de référence de chaque côté du pic. Interpolation linéaire pour soustraire l’absorbance interférante.

12 12 9Techniques de correction : Modélisation de fond Utilisée surtout lorsque l’interférence est causé par un processus physique comme la diffusion.

13 13 10Techniques de correction : Isoabsorbance Possible si on dispose du spectre de l’interférent à l’état pur.

14 14 11Techniques de correction : Dérivées Permet d’éliminer plusieurs interférences. Utiliser aussi pour la confirmation d’identité.

15 15 11Techniques de correction : Dérivées La dérivée première permet d’atténuer ce décalage. Le spectre de base présente un décalage de sa ligne de base. Utile dans certains contextes.

16 16 11Techniques de correction : Dérivées Élimination des interférences à larges bandes. Les dérivées successives éliminent les bandes larges mais pas les bandes étroites.

17 17 12Confirmation d’identité Spectre de base, un seul pic apparent. Cas de la testostérone: Dérivée seconde, plusieurs pics (en rouge s’il n’y avait qu’un seul pic absorption).

18 18 12Confirmation d’identité Une seule substance. Présence de 2 substances avec des pics d’absorption très rapprochés. Spectre 0 Dérivée quatrième Deux substances avec lamda max rapprochées.

19 19 12Confirmation d’identité Dérivées premières (des 2 spectres) Dérivées secondes Analgésique Colorant alimentaire

20 20 13Analyse multicomposante: méthode algébrique Principe d’additivité des absorbances : en tout point, l’absorbance du mélange est égale à la somme des A des 2 constituants séparés. Il est possible de calculer la concentration de chaque constituant dans le mélange si on dispose des spectres des substances à l’état pur.

21 21 13Analyse multicomposante: méthode algébrique Pour calculer la concentration de chaque constituant dans le mélange: 1- On calcule epsilon des 2 constituants (l=1cm) à son lamda max: A max1 = (  1- max1 )c 1 (point B) A max2 = (  2- max2 )c 2 (point C)

22 22 13Analyse multicomposante: méthode algébrique 2- On calcule ensuite epsilon de chaque constituant au lamda max de l’autre: A max2 = (  1- max2 )c 1 (point D) A max1 = (  2- max1 )c 2 (point E) 3- On résoud le système de 2 équations à 2 inconnus (C 1 et C 2 ) : A point G = (  1- max1 )c 1 + (  2- max1 )c 2 A point F = (  1- max2 )c 1 + (  2- max2 )c 2

23 23 14 Analyse multicomposante: déconvolution Exemple : filtre de Kalman des moindres carrés, permet de trouver de manière automatique, par approximations successives, le spectre échantillon par addition des spectres en mémoire de chaque composé affecté d’un coefficient de pondération. Cas de plusieurs constituants: on utilise un algorithme pour résoudre, il en existe plusieurs.