Conception d ’un dosage d ’IgE spécifiques

Présentation au sujet: "Conception d ’un dosage d ’IgE spécifiques"— Transcription de la présentation:

1 Conception d ’un dosage d ’IgE spécifiques

2 Composants allergéniques
ISAC IgE spécifiques Composants allergéniques Tests cutanés Clinique, histoire familiale, circonstances de survenue IgE spécifiques sources allergéniques Tests de « dépistage »

3 Principe du test in vitro
Prélèvement sanguin Réponse IgE Système immunitaire Allergène couplé à l’ImmunoCAP

4 Principe du dosage Prélavage ImmunoCAP Ajout 40 µl sérum Incubation 30 mn - 37°C Lavage Ajout 50 µl conjugué Incubation 24 mn - 37°C Ajout 50 µl Sol.Développement Incubation 9 mn Ajout 600 µl Sol. Inhibitrice ßGalactosidase (coli)+ 4-Méthylombelliféryl-ß-D-galactoside   4-Méthylombelliférone Les résultats sont donnés en KUA/l (Kilo Unité d’Allergène par litre). La limite de détection est de 0.01 KUA/l. Les résultats supérieurs à 0,10 KUA/l sont considérés comme positifs. Réponse IgE

5 PRINCIPE DE LA METHODE L’allergène à étudier, couplé par covalence à l’ImmunoCAP, réagit avec les IgE spécifiques de l’échantillon du patient. Après avoir éliminé par lavage les IgE non spécifiques, des anticorps IgE marqués par une enzyme sont ajoutés pour constituer un complexe. Après incubation, les anti-IgE-enzyme non liés sont éliminés par lavage et le complexe lié est incubé avec le réactif de développement. Après interruption de la réaction, la fluorescence de l’éluat est mesurée. Plus la réponse est élevée, plus la quantité d’IgE spécifiques présents dans l’échantillon est élevée. Pour évaluer les résultats du test, les réponses obtenues pour les échantillons de patients sont converties en concentratrion par l'intermédiaire d'une courbe de calibration.

6 Matériel utilisé : Le kit de réactifs pour l’Immuno CAP 250 est fourni par Phadia doit être maintenu à 2-8°C. Il contient : Le conjugué IgE spécifique : anticorps monoclonaux de souris anti IgE liés à la β-galactosidase : 1 μg/ml. contenant de l’azide de sodium 0.06%. 2) Les calibrateurs IgE spécifique: (pour la courbe de calibration) 5 strips d’IgE humaine en milieu tampon de différentes concentrations (0 ; 0.35 ; 0.7 ; 3.5 ; 17.5 ; 100 KU/L). 3) Les contrôles de courbes : 5 strips d’IgE humaine en milieu tampon. 4) Les crayons calibrateurs IgE spécifique : Tubes de 16 immuno cap : IgE (monoclonaux de souris) anti IgE 5) Solution de développement : 6 flacons de 4-Méthylombélliféryl-β-D-galactoside 0.01% Solution stop : 6 flacons (120ml) de carbonate de sodium 4%. Solution de lavage

7 Moyens mis en œuvre : phase solide adaptée à la complexité de l’allergène
Exigences : fixation de toutes les IgE spécifiques quelles que soient leur spécificité d’épitope et leur concentration Pas d’interférence des IgG spécifiques Solution : ImmunoCAP Polymère cellulosique tridimensionnel Très grande surface de couplage Représentation en excès de tous les constituants de la source allergénique

8 « Mousse » de cellulose

9 Capacité de couplage de l’ImmunoCAP

10 Moyens mis en œuvre : banque de sérums
Exigence : Vérifier la pertinence et la qualité de nos tests dans le temps Solution : sérothèque de plus de sérums documentés cliniquement validation des nouveaux tests développés : preuve de la responsabilité d’un mécanisme IgE médié connaissance des composants des extraits d'allergènes (nomenclature des allergènes) contrôle de la production des lots d'allergènes et la maîtrise de la reproductibilité entre les lots d'extraits (allergogrammes) contrôle des produits finis (25 sérums sont utilisés pour le contrôle de chaque lot d'allergène chez Phadia) Le terme hypersensibilité couvre toute réaction immunitaire non appropriée, exacerbée, devenant alors néfaste pour l’organisme lui-même car générant différents types de lésions. Le terme atopie caractérise une notion de terrain, certains individus ont une prédisposition (génétique) à synthétiser des IgE en quantité anormalement importante, et dirigées contre des éléments que l’organisme devrait normalement tolérer, comme les pollens, les poils d’animaux. Ces éléments sont appelés alors allergènes. Il est important dans cette définition de noter que l’on parle d’allergènes naturels entrant en contact avec l’organisme par des voies naturelles (inhalation, ingestion, voie transcutanée), car effectivement, l’allergie aux médicaments ou aux haptènes chimiques (allergènes non naturels) n’est pas liée au terrain atopique. De même, tout individu, atopique ou non atopiqu, peut être allergique aux venins d’Hyménoptères (contact par injection). Le terme allergie, lui, désigne l’expression clinique de symptômes liés à la présence de ces anticorps. Un individu atopique, placé dans un environnement peu allergisant, ne sera peut-être jamais allergique. Pour qu’il y ait allergie, il faut donc un terrain (atopique) et un environnement particulier qui va entraîner des symptômes, donc une allergie.

11 Moyens mis en œuvre : instrumentation fiable, robuste, reproductible
La gamme d’automates Phadia 100 Phadia 250 Phadia 1000

12 Sites de récolte suede chine USA italie japon

13 Ferme + laboratoire ACARIENS POLLEN EPITHELIUM ALIMENTS QUALITE MOISISSURE

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19 Composants allergéniques
- Natif : purification protéique - recombinant : e. coli

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21 2 step Assay (4 hours for the results)
ImmunoCAP ISAC® 112 2 step Assay (4 hours for the results) Serum incubation Antibody incubation Scanner 30 ul serum