D Le Tessier, A Coustier, L El Khattabi

Présentation au sujet: "D Le Tessier, A Coustier, L El Khattabi"— Transcription de la présentation:

1 UTILISATION DE LA PCR DIGITALE POUR LA RECHERCHE D’ANEUPLOÏDIES FŒTALES
D Le Tessier, A Coustier, L El Khattabi Laboratoire de Cytogénétique. Hôpital Cochin

2 Le diagnostic prénatal en france
54920 prélèvements invasifs en 2012 Données 2012, Agence Biomédecine

3 Anomalies diagnostiquées
11,2% de caryotypes avec anomalie Données 2012, Agence Biomédecine

4 procédure invasive Obtention de cellules foetales objectif
Villosités choriales Liquide amniotique Sang foetal objectif Obtention de cellules foetales Analyse de génétique moléculaire Mise en culture et établissement du caryotype foetal

5 MATERIEL FŒTAL DANS LE SANG MATERNEL
ADN fœtal libre circulant Cellules fœtales circulantes ARN fœtal circulant

6 MATERIEL FŒTAL DANS LE SANG MATERNEL
ADN fœtal libre circulant Cellules fœtales circulantes ARN fœtal circulant 6

7 ADN FŒTAL LIBRE CIRCULANT
Origine trophoblastique Relargage dans circulation maternelle dès 5-6 SA Augmentation de la concentration au long de la grossesse Mélangé à l’ADN maternel (ADNf = 5-10%) Concentration ADNf à relier avec autres facteurs ½ vie courte: 16min. Disparition rapide (- 48h) après accouchement ADN fragmenté : 140bp 7

8 PROBLEMATIQUES Techniques : Biologiques/interprétation
Faibles quantités Contamination maternelle nécessité de techniques très sensibles et précises: MPS PCR digitale  Importance du pré-analytique (tubes de prélèvement, traitement de l’échantillon, technique d’extraction) Biologiques/interprétation Faux positifs (MCP, clone maternel aneuploïde) Faux négatifs (aneuploïdies en mosaïque, proportion d’ADNf trop faible, grossesse gémellaire)

9 PCR digitale PCR classique PCR digitale point final point final
quantitative PCR classique point final qualitative PCR en temps réel quantitative

10 PCR digitale Partitionnement PCR Lecture 1 1 1 1 1 Quantification

11 PCR DIGITALE en micropuce

12 PCR DIGITALE en émulsion

13 PCR DIGITALE en émulsion
13

14 PCR DIGITALE en émulsion
PCR+ FAM PCR+ VIC PCR neg PCR+ FAM et VIC 14

15 PCR DIGITALE en émulsion
N PCR+ FAM N PCR+ VIC N total (+ et -) 15

16 PCR DIGITALE en émulsion
16

17 PCR digitale Avantages par rapport à la PCR en temps réel :
Technique plus sensible ( probabilité de rencontre entre l’ADN et les amorces-sonde,  phénomènes d’inhibition de PCR) Technique plus spécifique ( interactions entre différentes PCR) Pas besoin d’une courbe standard (c’est une vraie quantification absolue) 17

18 PCR digitale Applications : Virologie : charges virales résiduelles…
Génétique somatique : détection d’allèles mineurs (évènements rares)… Génétique constitutionnelle : détection de CNV, DPNI +++ (détection de sexe fœtal, RhD, aneuploïdies) « Digital PCR for the molecular detection of fœtal chromosomal aneuploidy » Y.M. Dennis Lo et al. PNAS, August 7,2007,vol 104 (32), l 18

19 PCR DIGITALE pour la trisomie 21
Mesure d’un ratio chromosomique 21/ref (≡ FAM/VIC) Fœtus euploïde  ratio = 1 Fœtus avec T21  ratio > 1 (valeur exacte dépend de la proportion d’ADNf. Par exemple, pr 10% d’ADNf, ratio = 1,05) FAM VIC 19

20 PCR DIGITALE pour la trisomie 21
Problématique : pour dire que 1,05 vraiment ≠ 1, il faut compter des milliers de molécules du 21. Or, la quantité d’ADN est limitée  idée du multiplexage avec des sondes de la même couleur FAM VIC 4 sondes FAM 4 sondes VIC 20

21 PCR DIGITALE : ETUDE DANNI
DANNI: Dépistage Anténatal Non Invasif des maladies génétiques (Coordonnateur: JM Dupont, Cochin) Etude multicentrique, accord CPP Objectif principal: Évaluer les performances/coût des nouvelles technologies de comptage moléculaire dans le dépistage de trisomie 21 PCR digitale MPS Critères d’inclusion: Grossesses à haut risque d’anomalie chromosomique (marqueurs sériques à risque élevé, anomalies à l’échographie, histoire familiale) Caryotype fœtal par prélèvement invasif

22 PCR DIGITALE : ETUDE DANNI
N = 220 échantillons d’ADN plasmatique (200 N, 20 T21) Description de la population étudiée : 35% MS1T+ 44% signes échographiques 14% MS1T+ et signes échographiques 3.6% histoire familiale 3.6% autres

23 PCR DIGITALE : ETUDE DANNI
Médiane 1,00 1,08

24 CONCLUSION Approche prometteuse, possibilité d’améliorations techniques (choix des sondes,  multiplexage) Place de la dPCR dans le DPNI ? Avantages dPCR : Simple, rapide, faible coût, moins de logistique => Compatible avec un dépistage en population générale Dépend des évolutions de coût et de technologie du MPS En cours : partenariat entre clinique canadienne et Biorad pour utilisation ddPCR pour le dépistage de la T21, proposition RainDance)

25 REMERCIEMENTS Cytogénétique – Hôpital Cochin Audrey Coustier
Laïla El Khattabi Jean-Michel Dupont Génétique – Hôpital Poissy Christelle Le Sciellour Valérie Serazin François Vialard DHU Risques et Grossesse Pr Vassilis Tsatsaris Françoise Le Rhun Camille Deput Rampon Pr Laurent Mandelbrot Pr Dominique Luton Gynécologie – Hôpital Poissy Patrick Rozenberg Alexandra Brette Berangère Duclos Plateforme ddPCR et MPS – Hôpital Cochin Juliette Nectoux Franck Letourneur Michel Vidaud Statistiques Raphael Porcher

26 1.MISES AU POINT TECHNIQUES - MATERIEL & METHODES
1. Digestion enzymatique de RASSF1A 3 types de tissus ADN placentaire ADN lymphocytaire ADN plasmatique RASSF1A hyperméthylé RASSF1A hypométhylé ADN maternel: hypométhylé ADN fœtal: hyperméthylé 5 protocoles de digestion P1 P2 P3 P4 P5 BSTUI HhaI + HpaII 60°C 37°C 1h puis 90°C 20 min 16h 1h 10 min Digestion par une enzyme méthyl-sensible Résistant digéré ADN maternel ADN fœtal résistant