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A Sorting Platform Determines the Order of Protein Secretion in Bacterial Type III Systems María Lara-Tejero, Junya Kato, Samuel Wagner, Xiaoyun Liu, Jorge.

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1 A Sorting Platform Determines the Order of Protein Secretion in Bacterial Type III Systems María Lara-Tejero, Junya Kato, Samuel Wagner, Xiaoyun Liu, Jorge E. Galán* DOI: /science , 1188 (2011);331 Science Présenté par Audrey Moine 1

2 Introduction Le système de sécrétion de type 3 Injection des effecteurs en une étape Machinerie de sécrétion (20aine de protéines, homologie flagelle) 2

3 Introduction Gram – 3 espèces, dont la principale est Salmonella enterica, elle-même divisée en 6 sous-espèces puis en serovar Ingestion orale Deux types de pathologies «Salmonellose» - Gastroentérites - Syndrome typhoïque Intracellulaire facultatif, ne sort pas de la vacuole Salmonella 3

4 Introduction Le système de sécrétion de type 3 chez S. enterica serovar Thyphimurium 4

5 Introduction Découverte dune protéine cytoplasmique SpaO conservée et possédant une forte similarité de séquence avec des composants du flagelle (C-ring) Homologie entre le flagelle et le SST3 5

6 Etude de la fonction des composants cytoplasmiques essentiels au SST3 chez S. Typhimurium Localisation de SpaO? Caractérisation des intéractions de SpaO avec dautres protéines Rôle de SpaO dans la hiérarchie de sécrétion translocases / effecteurs? Le rôle des chaperonnes? 6

7 I Localisation de SpaO Fig1.A: fractionnement subcellulaire de SpaO Environ 20% des protéines se trouve dans la fraction insoluble Quelle est la localisation subcellulaire de SpaO? 7

8 I Localisation de SpaO InvG, PrgH et PrgK sont des protéines du sécréton SpaO serait-elle en intéraction avec les protéines du sécréton? Fig1.B: la fraction insoluble est soumise à un gradient de sucrose, et les différentes fractions sont déposées sur gel SDS- PAGE puis révélées par Immunoblot. Beaucoup de SpaO se trouve dans la même fraction du gradient que les protéines du sécréton 8

9 I Localisation de SpaO Cractérisation du complexe SpaO Fig I.E: Immunoblot des fractions subcellulaires insolubles sur gel natif Les protéines du sécréton seraient en interaction avec la protéine SpaO 9

10 I Localisation de SpaO Cette localisation de SpaO est-elle dépendante du sécréton? Fig I.C: Les fractions insolubles de deux souches différentes sont soumises à un gradient de sucrose puis les différentes fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE La localisation subcellulaire de SpaO nest pas dépendante de la présence du sécréton 10

11 I Localisation de SpaO Cette localisation de SpaO est-elle dépendante de la membrane? Fig I.D: Les fractions insolubles, après différents traitements, sont déposées sur gel SDS- PAGE et SpaO est révélée par immunoblot SpaO forme donc un complexe à haut poids moléculaire même en absence de tous les composants membranaires du SST3 et de la membrane même Interaction avec dautres protéines cytoplasmiques?? 11

12 II Caractérisation du complexe SpaO Quels sont les composants du complexe SpaO? Fig I.B: Gel natif 2D des fractions du gradient de sucrose et identification des protéines par LC-MS/MS Il y a de nombreuses protéines du sécréton mais aussi des translocases et des protéines cytoplasmiques. Etude des protéines cytoplasmiques 12

13 II Caractérisation du complexe SpaO Est-ce qu OrgA et OrgB font partie du complexe SpaO? Fig 2.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. 13 Les protéines SpaO, OrgA et OrgB forment une partie dun complexe pouvant inclure les protéines du sécréton

14 III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO SipB fait-elle partie du complexe SpaO? Fig 3.B: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. SipB est présente dans le complexe SpaO OrgA OrgB. 14

15 SpaO OrgA et OrgB forment un complexe protéique pouvant sassocier à des protéines membranaires du SST3. Ce complexe peut aussi être composer de nombreuses translocases. Ce complexe pourrait servir de plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines Alors labsence des translocases devrait engendrer la présence des effecteurs dans le complexe? III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO 15

16 Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence des translocases? III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO Fig 3.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. Labsence de la translocase permet aux effecteurs SipA et SptP de se lier au complexe 16

17 Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases? III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO Fig 3.D: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. Labsence des translocases permet à leffecteur SopE de se lier au complexe. 17 Ce complexe est donc bien une plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines substrats

18 IV Le rôle des chaperonnes Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB? Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. Sans la chaperonne InvE les translocases ne peuvent plus se lier à la plateforme 18

19 Fig 4.A.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. IV Le rôle des chaperonnes Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB? Les chaperonnes sont requises pour la fixation des protéines sécrétées à la plateforme. 19

20 Conclusion Formation dune plateforme SpaO-OrgA-OrgB dans le cytoplasme pouvant être en interaction avec les protéines du sécréton Dabord liaison des translocases Ensuite liaison des effecteurs en absence des translocases Les chaperonnes sont requises pour ladressage des protéines sécrétées à la plateforme. 20

21 Conclusion 21

22 Discussion Lintéraction de PrgI avec la plateforme na pas été démontrée 22

23 Discussion Aucune piste sur la manière dont le complexe substrat-chaperonne informerait sur la hiérarchie de sécrétion question daffinité?? Généralisation de la nécessité des chaperonnes pour ladressage des protéines substrats à la plateforme Comment se fait la reconnaissance pour les effecteurs sans chaperonne? 23

24 Perspectives De nombreux points du modèle sont encore à éclaircir Contribution de la plateforme à lassemblage du sécréton? Applicable à la plupart des SST3 24

25 Merci de votre attention 25

26 II Carctérisation du complexe SpaO Quelle est la localisation subcellulaire dOrgA et OrgB? OrgA et OrgB se trouvent également dans les même fractions de gradient de gradient de sucrose que SpaO Fig 2.D: Immunoblot contre OrgA et OrgB sur gel SDS-PAGE des différentes fractions des gradients de sucrose. 26

27 SpaO, OrgA et OrgB sont-elles interdépendantes? Fig S.3: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. Les protéines SpaO, OrgA et OrgB formeraient une partie dun complexe pouvant inclure les protéines du sécréton II Carctérisation du complexe SpaO 27

28 Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases? III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO Fig 3.E: Gel SDS-PAGE des fractionnements subcellulaires En absence des translocases les effecteurs SptP et SipA sont beaucoup plus présents dans la fraction insoluble 28

29 III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO Fig 3.F: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. 29

30 Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB? Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. SicP est un cas particulier car elle reste fixée à la plateforme même après la fixation de leffecteur. IV Le rôle des chaperonnes 30

31 La reconnaissance du complexe se fait-elle par la chaperonne ou leffecteur? IV Le rôle des chaperonnes Fig 4.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application dun gradient de sucrose chez différentes souches. 31

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35 Action de InvJ Model of needle length control. Assembly of the inner rod but not the needle requires InvJ. Completion of the inner rod leads to conformational changes on the cytoplasmic side of the injectisome, which results in substrate switching and the interruption of secretion of the inner rod and needle proteins, hence determining the length of the needle substructure. In the absence of InvJ, the socket of the base is not formed and the inner rod fails to assemble. Consequently, the secretion machinery remains locked in a secretion mode competent for the secretion of the needle protein, resulting in non-functional injectisomes with abnormally long needles. Filled circles, needle protein PrgI; open circles, inner rod protein PrgJ. 35

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