Développement et validation d’une méthode de dosage du posaconazole par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem Julie Amyot 1, Robert Robitaille 1 et Pierre-Olivier Hétu 2 1 Département de biochimie, Hôpital Maisonneuve-Rosemont 2 Département de biochimie, Centre Hospitalier Universitaire de Montréal Résumé Objectifs: Développer une méthode de dosage du posaconazole par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS). Méthodes: Les concentrations de posaconazole ont été déterminées par HPLC- MS/MS suite à une extraction du sang total et à une précipitation des protéines. Six niveaux de calibrateurs (0,25 à 10,0 µg/mL) et deux niveaux de contrôles (1,5 et 5,0 µg/mL) ont été employés. La chromatographie a été effectuée en mode par gradient sur une pré-colonne C18, et le kétoconazole a été utilisé à titre de standard interne. Les paramètres MS de la méthode, la précision, l’exactitude, la suppression d’ions, la rémanence, l’effet de matrice, la limite de détection (LoD), la limite de quatification (LoQ) et la stabilité du posaconazole dans le plasma ont été évalués (n=5) Résultats: Le posaconazole a été quantifié en utilisant la transition d’ion m/z  La LoD a été évaluée à 0,25 µg/mL, valeur qui correspond également à la LoQ. La précision intra-essai et la précision inter-essai sont inférieures à 6,5 % et ce, pour les deux niveaux des contrôles. L’exactitude de la méthode, vérifiée en comparant les concentrations de posaconazole avec les valeurs attendues du plus petit calibrateur et du calibrateur élevé, est respectivement de 101,8 ± 4,18 % et de 100,5 ± 0,49 %. La présente méthode ne montre aucune suppression d’ions, confirmée par la méthode par ajout dosés. Le posaconazole se conserve dans le plasma à la température pièce ou à 4 o C, et ce, pour un durée se prolongeant jusqu'à sept jours. Discussion/Conclusion: Les résultats obtenus démontrent la validité du dosage du posaconazole par HPLC-MS/MS. De plus, cette méthode démontre une simplicité et une rapidité d’exécution qui permettrait de l’incorporer dans la routine d’un laboratoire de pharmacologie en milieu hospitalier. Introduction Le posaconazole est un antifongique triazolé prescrit à titre de traitement prophylaxique pour les infections fongiques systémiques telles que les aspergilloses invasives et les candidoses. Le mode d’action du posaconazole réside dans l’inhibition de l'enzyme responsable de la conversion du lanostérol en ergostérol, un composant essentiel de la membrane cellulaire des champignons. Les perturbations dans la biosynthèse de l'ergostérol causent des dommages importants à la membrane cellulaire en augmentant sa perméabilité, ce qui entraîne la lyse des cellules et la mort. À ce jour, le posaconazole n’est disponible qu’en suspension orale et présente une absorption intra et inter-individuelle variable. Le suivi thérapeutique du posaconazole s’avère être de première importance et une méthode de dosage robuste permettrait d’optimiser le suivi et de prévenir les effets secondaires associés au traitement. Méthodologie Performance analytique (suite) Discussion/Conclusion Étalons, contrôles de qualité (CQs) et échantillons patient 50  L plasma EDTA 30  L standard interne (kétoconazole) Précipitation des protéines 500  L MEOH Agitation, centrifugation 100  L Surnageant 100  L sulfate de zinc (6mM)Prétraitement Colonne: Pré-colonne Security Guard C18, 4 mm×3 mm, 10 m, Phenomenex) Phases mobiles: A: H2O + 0,1 % acide formique B: ACN 100% Débit: 0,6 mL/min Mode par gradient Phase mobile A: 80 % Phase mobile B: 20 % Vol. d’injection: 20  L Paramètres HPLC Produit: Posaconazole Fragments m/z: 701,3  614,3 Voltage du fragmenteur: 200 V Énergie de collision: 40 V Paramètres MS/MS Performance analytique Tableau I: Précision de la méthode La précision intra-essai a été déterminée sur l’analyse de deux niveaux de CQ dosés à cinq reprises dans un même essai et la précision inter-essai, sur l’analyse de deux niveaux de CQ dosés sur cinq essais indépendants. ÉchantillonPrécision intra-essaiPrécision inter-essai Moyenne (%)CV (%)nMoyenne (%)CV (%)n CQ 1,0 µg/mL1,135,8951,1510,75 CQ 5,0 µg/mL6,496,6556,4711,35 Tableau II: Exactitude de la méthode La précision inter-essai a été déterminée en comparant la concentration du posaconazole obtenue avec la concentration attendue de l’étalon le plus faible et de l’étalon le plus élevé et ce, sur cinq essai indépendants (n=5). LLOQ, lower limit of quantification; ULOQ, upper limit of quantification ÉchantillonExactitude inter-essai (n=5) Moyenne ± Écart-type (%)n LLOQ (0,25 µg/mL)101,8 ± 4,185 ULOQ (10,0 µg/mL)100,5 ± 0,495 Figure I: Vérification de la suppression d’ions (A) et de l’effet de matrice (B) La présence de suppression d’ions a été évaluée en ajoutant des concentrations équivalentes d’immunosuppresseurs dans des extraits de sérum sans médicament (Drug free serum (Lyphochek)), de plasma EDTA ou de sérum (n= 5 patients différents). Les pics obtenus de ces différents échantillons ont été comparés. Figure II: Stabilité du posaconazole dans le plasma conservé à la température pièce (A) et à 4 o C (B) Le posaconazole a été mesuré dans des échantillons plasmatiques (EDTA) laissés à la température pièce (A), ou à 4 o C (B) et ce, sur une période se prolongeant jusqu’à sept jours (n=3). A) B)  Le posaconazole est un inhibiteur de la formation d’ergostérol, un constituant essentiel des membranes cellulaires des champignons;  Le posaconazole présente une grande variabilité intra et inter-individuelle, d’où la nécessité d’un programme de pharmacovigilance thérapeutique accru;  Les résultats de la mise au point et de l’évaluation de la performance analytique démontrent la validité analytique de la présente méthode par HPLC-MS/MS;  La méthode de dosage du posaconazole développée démontre une simplicité et une rapidité d’exécution qui permet son incorporation dans la routine d’un laboratoire de pharmacologie en milieu hospitalier. But de l’étude Développer une méthode de dosage simple et rapide du posaconazole par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS). Remerciements  Remerciements aux technologistes médicaux (médicales) du laboratoire de pharmacologie-toxicologie du département de biochimie de l’Hôpital Notre-Dame du CHUM.  Remerciements à la SQBC pour une bourse de formation A)