Christian Dani (DR1 Inserm) Cellules Souches et Thérapie Cellulaire Christian Dani (DR1 Inserm) Laboratoire « Cellules Souches et Différenciation Faculté de Médecine (11ème étage) dani@unice.fr

Les Cellules Souches Embryonnaires et les Cellules Souches Adultes: Des Concepts aux Applications Cliniques

Cellule fonctionnelle Les différents types de cellules souches/ Récapitulatif Source Potentiel Type cellulaire Zygote Totipotent Cellule souche embryonnaire Blastocyste Pluripotent Cellule souche Multipotente Adulte Multipotent Potentiel limité Unipotent Organe Progéniteur Division limitée Progéniteur engagé Pas de division Cellule fonctionnelle Cellule différenciée

Plan de la Présentation 1) Les cellules souches embryonnaires de souris: évidence du potentiel thérapeutique (modèle de la maladie Parkinson). Les cellules souches embryonnaires humaines: Clonage thérapeutique, problèmes techniques et éthiques. Les nouvelles alternatives: Les chimères homme-animal et la conversion de fibroblastes de peau en cellules souches multipotentes (iPS). 4) Les cellules souches adultes: sources, abondance, potentiel thérapeutique. 5) Les cellules souches cancéreuses.

Les Cellules Souches Embryonnaires: Isolement (Martin Evans, Oliver Smithies) Inner Cell Mass Blastocyst (3.5 dpc) Isolated ICM Irradiated MEF or LIF KO (Mario Cappechi) In vitro differentiation, Cell Therapy

Les propriétés des cellules souches / Pluripotence / Médiateurs biologiques Le LIF : un effecteur capital dans le maintien de la pluripotence des cellules souches embryonnaires murines 24 heures 48 heures Cellule ES + LIF SANS LIF Cellules ES de souris

Les Cellules Souches Embryonnaires de Souris Isolées en 1981, ce n’est qu’en 1995 que pour la première fois on montre qu’elles peuvent, dans des boites de culture en laboratoire, différencier en de nombre type cellulaires Source potentielle de cellules thérapeutiques pour la médecine régénérative

Les Cellules Souches Embryonnaires: Potentiel Thérapeutique

Les Cellules Souches Embryonnaires et maladie de Parkinson Utilisation des neurones fœtaux: pourquoi envisager une autre source? - Lourdeur logistique des greffes de neurones fœtaux. - Source limitée: 6 fœtus par patient. Manque de contrôle de la qualité et la reproductibilité des préparations. En 1998, il est rapporté que les mES forment, après transplantation chez l ’animal, des neurones dopaminergiques avec des synapses. En 2002, mis en évidence de leur capacité à corriger certaines fonctions cérébrales après transplantation dans un modèle animal de la maladie de Parkinson.

Ole Isacson (Boston, USA) - Injections de cellules souches embryonnaires de souris dans le striatum d ’animaux dont les neurones dopaminergiques avaient été détruits. - Après 9 semaines: 56% des animaux possèdent des neurones dans la région injectée, et présentent des améliorations locomotrices. 24% des animaux ne possèdent pas d ’amélioration 20% développent une tumeur dans la région injectée et meurent.

Les Cellules Souches Embryonnaires: Les problèmes!

Les Cellules Souches Embryonnaires Humaines En novembre 1998, deux groupes (USA) rapportent l ’isolement de cellules souches embryonnaires à partir d ’embryons humains de 5 jours (fécondation in vitro et développement de l ’embryon dans le laboratoire pendant 5 jours avant d ’isoler les cellules souches). En 2001, il est rapporté qu ’elles peuvent dans la boite de culture au laboratoire former des neurones dopaminergiques (mais nécessite de nombreuses étapes et faible efficacité).

Transplantation de Cellules Souches Embryonnaires Humaines dans le cœur de rat après Infarctus (Publié fin Août 2007 par la société Geron) -Dérivation de cellules souches embryonnaires humaines en cardiomyocytes in vitro: 80% des cellules sont des cardiomyocytes Transplantation 4 jours après induction de l’infarctus Analyse 4 semaines après transplantation: Pas de formation de tumeur (temps suffisant?, efficacité de différenciation? Prolifération plus limitée des celllules humaines?) Amélioration de la fonction cardiaque

Utilisation des Cellules Souches Embryonnaires Humaines en Clinique Limites: - Rejet immunitaire. Une solution à l ’étude est le transfert de noyau de cellule somatique: Clonage thérapeutique. Problèmes éthiques

Le clonage thérapeutique Somatic cell Enucleated donnor oocyte Embryo Inner cell mass Blastocyst Cultured ICM cells Stem cells Pancreatic Islet cell Cardiac cell Nerve cells Painting from K. Malevitch

Le Clonage Thérapeutique: La Pratique Technique à efficacité très aléatoire: Taux de réussite chez animaux d’élevage: 1 pour 100 tentatives Février 2004 à Séoul: Premier embryon humain aurait été obtenu par clonage thérapeutique. Processus très lourd, peu efficace et très coûteux actuellement: 1 cellule souche à partir d’un individu a nécessité: 242 ovules, 16 femmes volontaires (2 cycles de super ovulation); Coût estimé: 100 000 Euros Nécessité d’effectuer des recherches fondamentales pour comprendre et améliorer le processus, ou développer des solutions alternatives.

Ethique Créer des embryons humains destinés à être détruits pour isoler les cellules souches: à partir de quand un embryon est un être humain? Risque d’instrumentalisation, commercialisation, du corps de la femme pour obtenir les oocytes pour le clonage thérapeutique. Risque d’ouvrir la porte au clonage reproductif.

Le clonage thérapeutique Somatic cell Enucleated donnor oocyte Embryo Inner cell mass Blastocyst Cultured ICM cells Stem cells Pancreatic Islet cell Cardiac cell Nerve cells Painting from K. Malevitch

Le clonage reproductif Somatic cell Enucleated donnor oocyte Embryo Inner cell mass Blastocyst FIV Surrogate mother Paintings from K. Malevitch

Loi Bioéthique En France: Clonage reproductif est passible de 20 ans de réclusion criminelle (interdiction internationale en cours) Clonage thérapeutique: Possibilité d’utiliser les embryons surnuméraires et d’importer des cellules embryonnaires humaines générées aux USA. Europe: Grande-Bretagne: Clonage thérapeutique autorisé. Pays-Bas, Belgique, Suède, Danemark, Finlande, Portugal :Autorisé par absence de loi. Interdit en Italie, Allemagne

Les Solutions Alternatives au Clonage Thérapeutique Les Embryons Homme-Vache Autorisation donnée en Grande-Bretagne en Septembre 2007. La création in vitro d’embryons « chimères » constitués d’un patrimoine génétique humain intégré dans un ovocyte de mammifère (vache, lapine). La reprogrammation des cellules de peau En Novembre 2008, une équipe Japonaise (Yamanaka) a pu reprogrammer des cellules de peau de humaines en cellules ayant toutes les caractéristiques des cellules souches embryonnaires, en les forçant à exprimer 4 gènes. Très faible rendement: 1/1000 Utilisation de virus comme vecteur

Les Solutions Alternatives au Clonage Thérapeutique La reprogrammation de cellules somatiques En juin 2007, une équipe Japonaise (Yamanaka) a pu reprogrammer des cellules de peau de souris en cellules ayant toutes les caractéristiques des cellules souches embryonnaires, en les forçant à exprimer 4 gènes. En décembre 2007 reprogrammation de cellules de peau humaine: Très faible rendement: 1/1000 Utilisation de virus comme vecteur

Génération de cellules iPS humaines Cellule de peau Enucleated donnor oocyte Embryo Inner cell mass Oct3/4 Sox2 Klf4 c-myc Blastocyst Cultured ICM cells (Painting from K. Malevitch) Stem cells iPS Pancreatic Islet cell Cardiac cell Nerve cells

Les Cellules Souches Adultes

Les Sources de Cellules Souches Adultes

Utilisation des Cellules Souches Adultes Humaines en Clinique Greffe de moelle osseuse (depuis 30 ans) Premier essai thérapie cellulaire chez l’homme: Traitement de l’insuffisance cardiaque (Pr Philippe Menasché (hôpital européen Georges Pompidou, Paris), par des cellules souches de muscle squelettique. Utilisation des cellules souches mésenchymateuses isolées à partir du stroma de moelle osseuse pour la régénération osseuse. « Osiris Therapeutics » commercialise des ostéoblastes (mélangés à une matrice) dérivés de cellules souches isolées à partir de volontaires. - Essai de thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire FSH. Limites dans l’utilisation des cellules souches adultes humaines: - Faible abondance dans les tissus (0,1-0,01% dans la moelle osseuse humaine). Amplification limitée ex vivo. Ne se différencient pas en tous types cellulaires (pas cardiomyocytes, neurones).

Source abondante de Cellules Souches Le Tissu Adipeux: Source abondante de Cellules Souches

Abondance du Tissu Adipeux

Why Would We Think that Adipose Tissue has any Multipotent Stem Cells? - Adipose Tissue regeneration following weight loss (dieting, liposuction,…). In obesity, the number of adipocytes increases dramatically. Approximately 10% of fat cells are renewed annually at adult age (Spalding KL et al. «  Dynamics of fat cell turnover in humans ».Nature. 2008 Jun 5). Generation of new adipocytes from a stem cell pool. Progressive Osseous Heteroplasia: Formation of ectopic osteoblasts, chondrocytes, within subcutaneous adipose tissue. Presence of multipotent stem cells.

Isolation of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cell Populations Adipose tissue young donors Stromal fraction Preadipocytes, Endothelial cells Pericytes, lymphocytes, smooth muscle cells.. Collagenase A digestion Adipocyte fraction Adipocytes Initial plating density: 1-2x103 cells/cm2 Collect adherent cells 12h after plating. Abondance: 1%-10%

In vitro Differentiation of hMADS cells Differenciation Ostéoblastes Chondrocytes Adipocytes Myocytes squelettiques

Isolation of hMADS Cells from 10 Donors Sample weight (mg) Cell population Anatomical area Donor age Passage Sex Karyotype Donor 1 F 2 years umbilical 300 32 Normal Donor 2 M 5 years pubic 400 40 Normal Donor 3 prepubic M 4 months 210 25 Normal Donor 4 F 7 years Ing. 2100 22 Abnormal Donor 5 F 1 month Ing. 200 12 Donor 6 M 1 year scrotum 200 30 Normal Donor 8 M 5 years Ing. 230 20 Normal Donor 9 M 6 years Ing. 100 20 Normal Normal Donor 10 M 10 years scrotum 500 25 Donor 11 F 2 months Ing. 160 30 Normal

Isolation of hMADS cell Clones Abundance of ASCs Stromal fraction of adipose tissue Ex vivo expansion (2 passages) : Cells plated at clonal density Efficiency of colony formation: 12% Clones that underwent mesenchymal differentiation No adipocyte/osteoblast 24% Osteoblasts only 4% Adipocytes only 24% Adipocytes+Osteoblasts 48%

Potentiel Thérapeutique des Cellules Souches du Tissu adipeux Humain Formation de Tissu Osseux après transplantation chez la Souris - Régénération Musculaire après transplantation dans la souris mdx, modèle animal de la myopathie de Duchêne (partenariat avec SCS Japon pour essai clinique) -Essai en cours pour le traitement de l’ischémie des membres inférieurs

Bone Tissue Formation in Nude Mice hMADS cells incorporated into IBS2 Biomaterial: 8 weeks after subcutaneous transplantation Cell-free IBS2 hMADSc-IBS2

Détection de Cellules Osseuses Humaines et Murines dans l’Os formé Cellules osseuses humaines Cellules osseuses murines

for Muscular Dystrophy Disease hMADS Cells for Muscular Dystrophy Disease

Restoration of Dystrophin in Cyclosporin A-treated mdx Mice by hMADS Cells 10 days after Transplantation Right Tibialis Anterior Left Tibialis Anterior 20 mm

Restoration of Dystrophin in Cyclosporin A-treated mdx Mice by hMADS Cells 10 days after Transplantation Right Tibialis Anterior Left Tibialis Anterior 20 mm