Techniques immunologiques utilisant des réactifs marqués Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) GRELIER – DURAND - POCHET

Principe et définitions  Techniques utilisant une mise en évidence des immuns complexes par un conjugué Conjugué = Ag - marqueur ou Ac - marqueur  Marqueur = molécule détectable Isotope radioactif : émission de rayonnements Enzyme : catalyse la formation d’un produit coloré Fluorochrome : émission de fluorescence

Conjugués Conjugué = Antigène ou Anticorps marqué Liaison du marqueur à l’Ag ou Ac laissant libre épitope ou paratope tout en diminuant leur affinité par rapport aux composés non marqués

Techniques en phase hétérogène ou homogène Formation des complexes immuns sur un support Nécessite des étapes de lavage Les plus utilisées Phase homogène : Complexes immuns formés en phase liquide Pas d’étape de lavage Activité du marqueur différente quand le conjugué est libre ou lié

Techniques directes et indirectes Marquage réalisé en 1 seule étape (hors lavages et révélation) 1 seul réactif utilisé Techniques indirectes : Marquage nécessitant plusieurs étapes Plusieurs réactifs utilisés Plusieurs complexes immuns formés

Techniques compétitives et non compétitives Compétition entre un élément recherché son homologue marqué Ajout simultané des réactifs Techniques non compétitives : Ajout successif des réactifs Lavages entre 2 réactifs ajoutés

Radioimmunologie (RIA) Marqueur = Isotope radioactif  élément chimique possédant les mêmes propriétés chimiques, le même Z que l’élément mais des masses atomiques différentes par nombre différent de neutrons caractérisé par une période ou demi-vie, un noyau énergiquement instable libérant de l’énergie sous forme de rayonnement : désintégration radioactive mesurée  Risque physique : utilisation limitée

Immunoenzymologie Marqueur = Enzyme Définition : catalyseur biologique se fixant spécifiquement sur un substrat catalysant la formation d’un produit Exemples : Phosphatase alcaline (PAL) PNPP incolore PNP jaune Peroxydase (HRP) catalysant l’oxydation de divers substrats par l’intermédiaire de H2O2

Ac anti-Salmonella-PAL ELISA non compétitive indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Salmonella dans un aliment Plaque 96 puits Produit (PNP) Substrat (PNPP) Lavage P P P P Ac anti-Salmonella-PAL S S S S Echantillon SAB Ac anti-Salmonella

ELISA compétitive directe en phase hétérogène Ex : dosage d’une toxine bactérienne Produit P Substrat S Lavage Toxine (échantillon) S P Toxine marquée = Conjugué S SAB : saturation Anticorps anti-toxine

Immunofluorescence Marqueur = Fluorochrome  molécule capable : d’absorber une lumière de faible longueur d’onde de passer un état excité de revenir à son état fondamental en émettant un rayonnement lumineux de longueur d’onde plus élevée S1’ S1 Énergie absorbée h ex Énergie émise h em So temps

Fluoresceine IsoThioCyanate Tetraméthyl Rhodamine IsoThioCyanate Marqueurs Principaux fluorochromes utilisés Absorption Émission FITC Fluoresceine IsoThioCyanate 495 nm 525 nm TRITC Tetraméthyl Rhodamine IsoThioCyanate 545 nm 575 nm

Microscope à épifluorescence Émission d’un rayonnement intense (UV et visible) par une lampe à vapeur de mercure ou faisceau LASER Focalisation par une lentille Sélection du spectre par un filtre d’excitation (490 nm) Diffraction du faisceau par le miroir dichroïque via l’objectif vers l’objet Excitation du fluorochrome Émission d’un rayonnement de plus faible énergie passant par l’objectif le miroir dichroïque un filtre sélectionnant les longueurs d’onde (> 500 nm) l’oculaire

Fixation du prélèvement Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Ac anti -Taylorella Lame IFI Fixation du prélèvement

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages

Conjugué : Ac anti Ig - FITC Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Conjugué : Ac anti Ig - FITC

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages

Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument - Résultats +

Immunofluorescence : autres techniques Immunofluorescence directe en phase hétérogène Immunofluorescence en phase homogène (cytomètre de flux) Immunofluorescence indirecte sandwich