La Cytométrie en flux.

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1 La Cytométrie en flux

2 La cytométrie en flux La Cytométrie Le Flux Comparaison d’échantillons
Mesure des cellules Comparaison d’échantillons Paramètres physiques Paramètres chimiques (sondes fluorescentes) Paramètres biologiques Microscope, photos numériques Le Flux Dénombrement de particule Passage une à une devant le détecteur Liquide en mouvement

3 La cytométrie en flux Le Principe La focalisation hydrodynamique
Le laser La focalisation hydrodynamique La focalisation du laser La diffraction du laser Séparation des signaux Les résultats

4 La cytométrie en flux Le principe : le laser
laser Argon 488nm Raie lumineuse monochromatique Un seul type de photons (dans le bleu) Forme elliptique après focalisation Faisceau d’éclairement très concentré COULTER® EPICS® XL

5 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique
P2>P1 P2 d1 d1 >> d2 d2

6 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique
Manchon liquidien : 50 à 100 µm Suspension cellulaire :10 à 15 µm 100 12 1 ml de cellules 106/ml: 12 µm de diamètre colonne de cellules de 9 km 1 cellule / 0.9 cm

7 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation du laser
FOCALISATION LASER Le diamètre d'un faisceau laser : 0,7 mm peu précis Lentilles de focalisation 2 lentilles permettent de focaliser le laser de manière à obtenir un faisceau elliptique proche, en taille, des événements à analyser : TRES PRECIS

8 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale
e-V photodiode

9 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale
Diffusion dans l’axe Forward scatter (FS, FSc) Diffraction ++ Réflexion +/- Réfraction +/- Taille des particules

10 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale
Réflexion Réfraction

11 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale
Diffusion à angle droit Side scatter (SS, SSc) Diffraction - Réflexion ++ Réfraction + Hétérogénéité du contenu cellulaire

12 La cytométrie en flux Le principe : la diffraction du laser
Diffusion axiale Laser Diffusion latérale fluorescence

13 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux
Spécificité relative Fluorochrome spécifique pour un constituant de la cellule Toutes les cellules marquées Ac.Nucléiques Protéines Ions Spécificité absolue Fluorochrome lié à une molécule biologique Substrat fluorogène Ligands: FC, AnV, lectines Anticorps

14 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux
Sondes fluorescentes: plusieurs fluorescences pour chaque cellule Filtres optiques Fluo1 Fluo2 Fluo3

15 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux
Filtres colorés absorbants Filtres interférentiels Miroirs dichroïques

16 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux
500nm 800nm 700nm 600nm FITC PE ECD PECy5 Emission Relative Fluorescence 

17 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux
D1, D2, …: photomultiplicateurs

18 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux

19 La cytométrie en flux Les résultats : la chaîne d’acquisition
PMT eV h 0V 10V Ampli CAD 1023

20 La cytométrie en flux Les résultats : Digitalisation / Histogramme
Intensité du signal 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1023

21 La cytométrie en flux Les résultats : analyse d’histogramme
intensité de fluorescence 1023 N % Moy, CV, ...

22 Histogramme de Distribution Spectre de fluorescence
- graphe - courbe - profil Histogramme de Distribution N intensité Spectre de fluorescence intensité 

23 La cytométrie en flux Les résultats
Représentation des résultats sous forme d’histogrammes de distribution de fréquence. Analyses de populations dans des échantillons hétérogènes ? moy

24 La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique
1 2 3 4 N Paramètre 1 Paramètre 2

25 La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique

26 La cytométrie en flux Les résultats : Combinaison de paramètres

27 La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement de l’analyse
Diffusion Axiale Diffusion latérale Diffusion Axiale Diffusion Axiale Diffusion Axiale

28 La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement couleur
Diffusion latérale Diffusion axiale Diffusion latérale Diffusion axiale

29 La cytométrie en flux Synthése
fluo2 fluo3 électronique fluo1 diffusion laser

30 La cytométrie en flux Les résultats : immunofluorescence
Excellente spécificité (Ac) théorique Nombreux contrôles nécessaires Spécificité de l’Anticorps Fixation non spécifique pour l’antigène Affinité

31 La cytométrie en flux Les résultats : Le contrôle négatif
Lecture dérivée des observations au microscope 1 Ac négatif Ac marqueur 2

32 La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8
Sang Lyse des GR Diff. Latérale Diff. Axiale Anti-CD8 Anti-CD4

33 La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8
65% 20%

34 La cytométrie en flux Applications : Analyse des leucémies
Diffusion latérale CD45 Leuco Ery

35 La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire
Marqueurs de l’ADN Intercalants Spécificité relative

36 La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire
G M Colc G M Fluorescence proportionnelle à ADN Cam G M Dnr G M

37 La cytométrie en flux Applications : Analyse de l’apoptose
Marqueurs membranaires Marqueurs mitochondriaux Marqueurs enzymatiques

38 La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC
-phospatidylsérines Intactes -Annexine V-FITC Apoptose rouge Nécrose Iodure de propidium vert

39 La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC / IP
Témoin CHX Apotose tardive ou nécrose IP Apotose AnV TNF TNF+CHX

40 La cytométrie en flux Le tri par CMF
Cellules en suspension dans un jet de liquide Formation de goutellettes Charge Electrostatique Déviation des gouttelettes

41 La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes
Technologie dérivée des imprimante à jet d ’encre Jet de liquide instable dans l ’air  gouttelettes Oscillations modifient le point de rupture

42 La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes
30kHz d=Cte

43 La cytométrie en flux Le tri par CMF : La Charge des gouttelettes
t (µs) ? - + ?

44 La cytométrie en flux Le tri par CMF : La déviation des gouttelettes
- + + - + + - 3000 V + - - +

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46 Cellules Liquide de veine +/- Electronique Détecteur +3000 V -3000 V

47 La cytométrie en flux Le tri par CMF
Technique longue Sélection sur plusieurs paramètres à la fois Choix entre pureté et rendement Bonne pureté >95% Clonages Préparations pour : Mise en culture Biologie moléculaire Western blots Activité enzymatiques Etc …

48 La cytométrie en flux Le tri par CMF: Tri des cellules NK
64% CD56+ Enricht rosette 1,3% CD56+ CD56 SSc 99% CD56+ Tri CMF

49 La cytométrie en flux Le tri par CMF: Inhibiteurs des caspases
Jurkat 7C11 3 h neg low high