Laboratoire de Génétique des Tumeurs Solides Méthodes de biologie moléculaire adaptées à la génomique des tumeurs solides Laurence Bianchini Laboratoire de Génétique des Tumeurs Solides CNRS-UMR6543 Nice

PLAN Techniques basées sur la PCR (1) Principe de la PCR PCR conventionnelle DOP-PCR RT-PCR Exemples d’application: recherche de gènes de fusion caractéristiques cas du dermatofibrosarcome protuberans (DP) cas du synovialosarcome RACE-PCR Exemple d’application: identification d’un gène de fusion impliquant HMGA2 dans un cas de lipome

PLAN Techniques basées sur la PCR (2) PCR quantitative ou en temps réel Principe Méthodes de détection Détermination du cycle seuil Quantification de l’expression des ARNm par RT-PCR quantitative Exemple d’application de RT-PCR quantitative

PLAN Techniques non basées sur la PCR Southern blot Northern blot

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR Permet d ’obtenir, à partir d ’un échantillon complexe et peu abondant, d ’importantes quantités d ’un fragment d ’ADN spécifique et de longueur définie (million de copies en quelques heures). Succession de réactions de réplication d ’une matrice double brin d ’ADN (amorces ou « primers ») Utilisation des produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes (amplification exponentielle)

PCR

PCR Optimisation du choix des oligonucléotides et des conditions de PCR Nombre de cycles (entre 25 et 40) Optimisation des conditions de PCR: Concentration en MgCl2 Quantité d’ADN matrice Concentration en amorces Spécificité des amorces 18 à 24 nucléotides 40 à 60 % de GC Température d’accrochage des amorces (phase d’ annealing) calculée en fonction du Tm (température de fusion) des deux amorces

PCR Risques de contamination Principe de la PCR: amplification considérable Risque de contamination très élevé Travail sous une hotte Circuit monodirectionnel extraction et purification préparation des échantillons pour la PCR analyse des échantillons sur gel d’agarose Obligatoire en PCR diagnostique

Techniques de PCR PCR conventionnelle DOP PCR RT-PCR Matériel de départ en très petite quantité PCR conventionnelle Sur ADN Séquence du fragment à amplifier connue, amorces spécifiques DOP PCR Séquence inconnue, amorces dégénérées RT-PCR Sur ADNc obtenu à partir d’ARNm Séquence connue, amorces spécifiques 5’ RACE PCR - Séquence connue en 3’, amorce spécifique - Séquence inconnue en 5’

DOP PCR Degenerated Oligonucleotide-Primed PCR Méthode universelle pour l’amplification non spécifique et uniforme de l’ADN Peut être utilisée comme étape de préamplification pour les applications suivantes: CGH (comparative genomic hybridization) Hybridation in situ sur chromosomes microdissectés Amplification par DOP-PCR Incorporation de nucléotides fluorescents FISH sur chromosomes normaux Grattage 5 à 10 copies 4p

DOP PCR Amorce de Télénius: 22 bases: 5’ CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG 3’ Amorces nucléotidiques « dégénérées »: amplification du maximum de séquences cibles d’ADN Amorce de Télénius: 22 bases: 5’ CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG 3’ 10 bases en 5’ spécifiques (site de restriction rare), les 6 suivantes sont dégénérées et les 6 bases en 3’ sont spécifiques Reconnaît le plus grand nombre de sites dans le génome humain 1ère étape: 5 cycles de préamplification hybridation non spécifique à la matrice d’ADN par leur partie 3’ dégénérée (30°C) 2ème étape: amplification spécifique (hybridation à 62°C)

Reverse Transcription-PCR RT-PCR Reverse Transcription-PCR

RT-PCR La PCR est réalisée après transcription inverse d ’un acide ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire (ADNc). Mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d’amplification de la PCR. Méthode la plus sensible pour détecter les ARN messagers au niveau d’un organe, d’un tissu ou d’une cellule.

In vivo Transcription (noyau) In vitro Synthèse d’ADNc et amplification

RT-PCR

Translocations et gènes de fusion dans les sarcomes Type de sarcome Translocation chromosomique Gène de fusion Sarcome d’Ewing t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI1 t(21;22)(q22;q12) EWS-ERG t(7;22)(p22;q12) EWS-ETV1 t(2;22)(q33;q12) EWS-FEV t(17;22)(q21;q12) EWS-EA1F Liposarcome myxoïde t(12;16)(q13;p11) FUS-DDIT3 t(12;22)(q13;q12) EWS-DDIT3 Sarcome à cellules claires EWS-ATF1 Sarcome alvéolaire des tissus mous t(X;17)(p11;q25) ASPL-TFE3 Tumeur desmoplastique à petites cellules rondes t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 Chondrosarcome myxoïde t(9;17)(q22;q11) TAF2N-CHN Chondrosarcome myxoïde extra-squelettique t(9;22)(q22;q12) EWS-CHN Fibrosarcome congénital t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 Histiocytome fibreux angiomatoïde TLS-ATF1 Rhabdomyosarcome alvéolaire t(1;13)(p36;q14) PAX7-FRHR t(2;13)(q35;q14) PAX3-FRHR Sarcome stromal endométrial t(7;17)(p15;q21) JAZF1-JJAZ1 Synovialosarcome t(X;18)(p11;q11) SYT-SSX1,2 Dermatofibrosarcome protuberans t(17;22)(q22;q13.1) COL1A1-PDGFB Osteosarcome indifférencié t(6;22)(p21;q12) POU5F1-EWS

DP : principales caractéristiques cliniques Rare : 0,1% des tumeurs Rarement métastatique (~1% des cas) Evolution lente Classiquement chez le jeune adulte Tumeur infiltrante, récidivante Traitement chirurgical par exérèse large (marges 5 cm) Prolifération fuso-cellulaire dermo-hypodermique dense de disposition « storiforme » fortement CD34+ 2

DP : analyse cytogénétique et moléculaire Dermatofibrosarcoma protuberans chez l’adulte : Dermatofibrosarcoma protuberans pédiatriques : Chromosome en anneau surnuméraire 17 22 translocations non équilibrées t(17;22)(q22;q21.3) Analyse moléculaire a mis en évidence la présence d’un même gène de fusion: COL1A1-PDGFB Métaphase COL1A1 PDGFB fusion coupes tumorales congelées ou coupes fixées (sauf Bouin) Noyaux interphasiques COL1A1 fusion PDGFB 4

DP : diagnostic moléculaire par RT-PCR 10 kb 1 kb 200 bp ARNm ARNr P C COL1A1 - 17q21 PDGFB 22q12 ~ 3340 bp PDGFB exon 2 Exon 6 à 49 COL1A1 5’ 3’ I II III IV Multiplexes Simplexes Clonage séquençage Stratégie : 3’ 7

Exemple de diagnostic par RT-PCR: le synovialosarcome Détection du gène de fusion SYT/SSX b c d a b c d 1ère étape: détection du gène de fusion SYT-SSX chez les patients b et d 2ème étape: distinction gène de fusion SYT-SSX1 vs SYT-SSX2 par coupure enzymatique (Taq 1) chez les patients b et c

Techniques de PCR (1) Matériel de départ en très petite quantité RT-PCR Sur ADNc obtenu à partir d’ARNm Séquence connue, amorces spécifiques

Rapid Amplification of cDNA ends RACE-PCR Rapid Amplification of cDNA ends

Techniques de PCR (2) 5’ RACE PCR 3’ RACE PCR PCR sur ADNc obtenu à partir d’ARNm Séquence connue en 3’, amorce spécifique Séquence inconnue en 5’ 3’ RACE PCR Séquence connue en 5’, amorce spécifique Séquence inconnue en 3’

RACE-PCR 5’ RACE-PCR 5’ ? 3’ Gène identifié 3’ RACE-PCR 5’ CCCCC 5’RACE 3’ RACE Anchor sequence

Exemple de l’utilisation de 3’ RACE-PCR: détection du gène de fusion HMGA2-MSRB3-NFIB dans un lipome FISH: HMGA2 exons 1-3 NFIB exons 4-9

PCR quantitative (q-PCR) ou en temps réel (Real Time PCR)

Principe de la PCR conventionnelle Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol Elongation 72°C 55°C 95°C x 35 cycles Séparation électrophorétique

PCR en temps réel La PCR en temps réel permet la détection et la quantification d’un reporter fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR (en temps réel)

Nigel Walker, NIEHS (www)

PCR conventionnelle versus PCR quantitative Analyse en point final sur gel d’agarose Phase plateau Analyse dynamique de la PCR quantitative Phase linéaire Phase exponentielle

Trois méthodes de détection: (TaqMan, Beacons, Scorpions) Real-time PCR Trois méthodes de détection: 1. Sondes d’hydrolyse (TaqMan, Beacons, Scorpions) 2. Sondes d’hybridation (Light Cycler) 3. Composés liant l’ADN (SYBR Green)

Trois méthodes de détection: (TaqMan, Beacons, Scorpions) Real-time PCR Trois méthodes de détection: 1. Sondes d’hydrolyse (TaqMan, Beacons, Scorpions) 2. Sondes d’hybridation (Light Cycler) 3. Composés liant l’ADN (SYBR Green) Fluoresces when bound to dsDNA (X1000)

PCR quantitative SYBR ®Green Mesure de fluorescence en fin d’élongation

PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol 5’ 3’ FP RP Reporter Quencher 5’ 3’ -Spécificité l’amorce pour la PCR -Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® Fluorescence 5’ 3’ FP RP R Q -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® -au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde 5’ 3’ FP RP R Q 5’ 3’ FP RP R Q -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

Rn Ct cycle Détermination du Ct (cycle seuil) 10 2O 3O 4O 5O 1 2 3 4 Ct Ct: cycle seuil, cycle de PCR pour lequel le signal fluorescent atteint la valeur du seuil (phase exponentielle) Rn: signal fluorescent normalisé par une référence fluorescente passive Seuil: calculé sur le signal normalisé durant les cycles précoces de la PCR (ligne de base) Bruit de fond Ligne de base

Courbes de calibration : comparer les valeurs de Ct Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents Le Ct est directement lié à la quantité de cible présente dans l’échantillon au début de la PCR

Quantification absolue Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 101 106 105 104 103 102 Ct Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible

Transcription inverse de l’ARN en ADNc (reverse transcriptase) Application de la PCR quantitative: quantification relative des ARNm RT-PCR quantitative tissu Extraction de l’ARN Transcription inverse de l’ARN en ADNc (reverse transcriptase) PCR quantitative

Quantification relative des ARNm par RT-PCR quantitative Il faut déterminer: - Un échantillon calibrateur Par rapport auquel sera déterminé le niveau d’expression du gène cible dans les échantillons inconnus Un gène de référence Normalisation de la quantité d’ARN sur laquelle on effectue la RT-PCR

Quantification relative des ARNm par RT-PCR quantitative Le gène de référence L’utilisation d’un gène domestique (housekeeping gene) comme référence permet de normaliser: Le processus d’extraction La qualité de l’ARN L’efficacité de l’étape de transcription inverse Importance du choix du gène de référence le plus pertinent

Quantification relative des ARNm par RT-PCR quantitative Choisir un calibrateur Représente l’état normal en terme physiologique (normalisation des résultats) Exemples: - culture cellulaire non traitée par une drogue - organe non atteint dans une pathologie - lignée sauvage

Quantification relative des ARNm par RT-PCR quantitative Exemples de gènes de référence Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Beta-actin RPLP0 (ribosomal protein large P0)

Quantification relative des ARNm par RT-PCR quantitative Ratio Echantillon inconnu = Qté Gène cible / Qté Gène Référence Ratio Echantillon calibrateur = Qté Gène cible / Qté Gène Référence Expression normalisée Gène cible = Ratio Echantillon inconnu / Ratio Echantillon calibrateur

Quantification de l ’expression du gene Myc dans des tumeurs du sein par RT-PCR en temps réel Courbes de calibration Bieche et al, 1999

Quantification de l ’expression du gene Myc dans des tumeurs du sein par RT-PCR en temps réel Bieche et al, 1999 Résultats: surexpression de Myc dans tumeur MYC42 (19x) et dans la tumeur MYC98 (5x)

Les chromosomes géants ou en anneau sont des marqueurs des liposarcomes bien différenciés MDM2 12 MDM2 WCP 12

Analyse par RT-PCR en temps réel des gènes MDM2 et CDK4 dans des liposarcomes bien différenciés et des lipomes Fold induction

HMGA2: un gène clé dans la physiopathologie des tumeurs adipeuses Amplifié et surexprimé dans les LBD/LDD FISH RT-PCR en temps réel Immunohistochimie 51 51

The real-time machine is connected to a computer and software on the computer is needed to run the real time PCR machine in real-time mode.

3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels 1. halogen tungsten lamp www.biorad.com 2a. excitation filters 2b. emission filters 1. halogen tungsten lamp 4. sample plate 3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels

Avantages de la PCR quantitative * L’amplification peut être suivie en temps réel * Rapidité et possibilité de traiter un grand nombre d’échantillons en même temps * Pas de traitement post-PCR, meilleur contrôle de la contamination * Gamme dynamique de concentrations très large (5 à 8 log) * Nécessite 1000 fois moins d’ ARN qu’une méthode conventionnelle * Détecte des variations d’expression jusqu’au seuil minimal d’un facteur 2 * Méthode la plus sensible, la plus précise, la plus reproductible * Pas plus chère que la PCR conventionnelle (à l’exception du coût de l’équipement)

Techniques de PCR (1) Matériel de départ en très petite quantité PCR conventionnelle: Sur ADN Séquence du fragment à amplifier connue, amorces spécifiques DOP PCR Séquence inconnue, amorces dégénérées RT-PCR Sur ADNc obtenu à partir d’ARNm Séquence connue, amorces spécifiques

Techniques de PCR (2) 5’ RACE PCR PCR temps réel RT-PCR temps réel PCR sur ADNc obtenu à partir d’ARNm Séquence connue en 3’, amorce spécifique Séquence inconnue en 5’ PCR temps réel Sur ADN Séquence connue, amorces spécifiques RT-PCR temps réel

Techniques non basées sur la PCR le Southern Blot le Northern Blot

Southern et Northern blots Nécessitent un matériel de départ en grande quantité - ADN pour le Southern - ARN pour le Northern

Le Southern Blot

Southern blot (1) 1- clivage enzymatique de restriction 2- électrophorèse sur gel d’agarose

Southern blot (2) 3- dénaturation dans le gel des fragments de restriction 4- transfert sur support solide par capillarité (buvardage) 5- fixation de l’ADN sur la membrane par cuisson (mb nitrocellulose) ou exposition UV (mb nylon) 6- hybridation avec une sonde marquée complémentaire 7- lavages 8- autoradiographie

Le Northern Blot

Le Northern Blot (1) Principe identique à celui du Southern Blot mais ce sont les ARN (ARNm) qui sont étudiés (pas de digestion par enzymes de restriction) La visualisation d’un ARN par une sonde permet de: apprécier sa distribution dans les tissus, étudier son abondance relative déterminer sa taille détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d’épissage de l’ARN

Northern blot (2) 1- Extraction des ARNm et purification 1 2- Electrophorèse sur gel d’agarose en conditions dénaturantes 2 3- Visualisation des ARNm par coloration au BET sous UV 4- Transfert des ARNm du gel sur une membrane (nitrocellulose ou nylon) 3 4

Northern blot (3) 2 ARNm différents sont liés à la mb. Incubation de la mb avec une sonde spécifique (ADN simple brin, ARN ou oligonucleotide) homologue à l’un des 2 ARNm présents sur la mb. La sonde porte un indicateur permettant la détection ultérieure du signal. Lavages éliminant la sonde qui n’est pas liée de façon spécifique à l’ARNm sur la mb. L’ARNm A est l’ARNm spécifique complémentaire à la sonde.

Exemple de Northern Blot