BIOPUCE ELECTRONIQUE NANOGEN. NANOGEN  Biopuce Nanochip ®  Plate-Forme Nanogen  Applications  Principes.

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1 BIOPUCE ELECTRONIQUE NANOGEN

2 NANOGEN  Biopuce Nanochip ®  Plate-Forme Nanogen  Applications  Principes

3 Principe 1  Toute molécule biologique chargée

4 Principe 2  Application d’un champ électrique orienter et concentrer les molécules biologiques vers un site spécifique de la biopuce

5 Principe 3  Un film hydrogel contenant de la streptavidine permet de fixer de façon forte les molécules biotinylées

6 Principe 4  Interprétation des résultats par hybridation moléculaire à l’aide de sondes fluorescentes

7 Biopuce Nanochip ®

8 Pads (Sites) Connexions (Filaments en platine)

9 Biopuce Nanochip ® Électrode en platine Site réactionnel de 80µ de diamètre Support en silicone

10 Biopuce Nanochip ® Électrode en platine Film hydrogel (streptavidine)

11 Orientation électronique de l’ADN - Adressage Acide Nucléique - - - - - - - - +

12 + Orientation électronique de l’ADN - Adressage

13 Hybridation - Stringence

14  Pads activés individuellement Possibilité de réaliser une puce avec: Caractéristiques Système Nanogen ®  Soit 100 échantillons différents (Amplicons)  Soit avec 100 sondes différentes (Oligonucléotides)

15  Possibilité de déshybrider et réhybrider sur un même amplicon Optimisation de la biopuce Caractéristiques Système Nanogen ®  un pad : utilisé pour rechercher plusieurs mutations

16  Possibilité de travailler en multiplex Caractéristiques Système Nanogen ®  x amplicons de différentes régions codantes de même origine  x amplicons d’origine différente (screening par exemple)

17  Facile à utiliser Caractéristiques Système Nanogen ®  Automatisé  Reproductibilité et gain de temps

18 Plate-Forme Nanogen ®

19 Plate-Forme Nanogen ® Chargeur  Addressage des échantillons Capacité: 1 à 4 cartouches

20 Plate-Forme Nanogen ® Lecteur  Application de la stringence thermique électronique chimique  Lecture des résultats 2 lasers 635 nm 532 nm {

21 Plate-Forme Nanogen ® Cartouche vierge Microplaque 96 ou 384 puits (échantillons) Addressage Cartouche chargée Lecture et analyse des résultats

22 Plate-Forme Nanogen ® Logiciel 1234 2 34 1 4

23 Plate-Forme Nanogen ® Résultats

24 Résultats générés automatiquement

25 APPLICATIONS  Recherche de mutations ponctuelles Génotypage de SNP

26 SNP – 2 Formats AMPLICON DOWN SNP B Sonde Stabilisatrice Reporter 3’5’ SNP B 5’ AND muté 3’ Sonde Stabilisatrice Reporter 3’ 5’ 5’ ADN sauvage 3’ CAPTURE DOWN 5’ ADN sauvage 3’ SNP B Sonde de Sonde Capture Reporter 3’ 5’ SNP B 5’ ADN muté 3’ Sonde de Sonde Capture Reporter 3’ 5’ Cy3 Cy5

27 SNP – 2 Formats Cy5 Cy3 CAPTURE DOWN Addressage des sondes de capture biotinylées Hybridation électronique des produits PCR Hybridation passive du couple de sondes reporters Application de la stringence AMPLICON DOWN Addressage des produits PCR biotinylés Hybridation passive des sondes stabilisatrices et du couple de sondes reporters Application de la stringence Cy5 Cy3

28 SNP Utilisation de reporters universels SNP Utilisation de reporters universels 5‘ 3‘ SNP Sonde stabilisatrice Séquence spécifique Séquence M13 Reporter Universel ADN sauvage

29 APPLICATIONS  Recherche de STR Génotypage

30 STR 3’ RR R R R R R R RRRRRR RRRRRR RR R RRRR RRRRRR RRRRRR R RRRRRR RRRR R RRRRRR RRR 5’ Sonde stabilisatrice à 3 répétitions Hybridation parfaite Sonde stabilisatrice à 4 répétitions Sonde stabilisatrice à 5 répétitions Sonde stabilisatrice à 6 répétitions Sonde stabilisatrice à 7 répétitions

31 STR Addressage des produits PCR biotinylés des échantillons Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3 Echantillon 4

32 STR N = 3 4 5 6 7 Hybridation électronique des N sondes stabilisatrice 5 répétitions 4 répétitions 3 répétitions 6 répétitions 7 répétitions

33 STR Hybridation passive de la sonde reporter Cy3 Application de la stringence Hybridation parfaite

34 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 100 200 300 400 500 600 MFI/s 6 7 8 9 10 11 12 13 7 8 9 10 11 12 13 14 15 STR 1 8 allèles STR 2 9 allèles Nombre de répétitions STR

35 APPLICATIONS  Recherche de mutations inconnues SNPmining

36 SNPmining Adressage de l’ADN de référence  ADN de référence biotinylés adressés électroniquement sur chaque pad  dénaturés au NaOH

37 SNPmining Hybridation de l’ADN test  ADN des échantillons à tester sont hybridés électroniquement à l’ADN de référence  Ils sont marqués au Cy3 de manière à vérifier l’efficacité de l’hybridation

38 SNPmining Incubation en présence de la protéine SNPmine™ SNPmine™-Cy5 ADN sauvage. La protéine ne se fixe pas ADN présente une mutation reconnue par la protéine

39 APPLICATIONS  Expression de gènes

40 5’ AAA ARNm Primer antisens 3’ 5’ ADNc Transcription Réverse Expression de gènes Transcription Réverse Expression de gènes Transcription Réverse

41 Expression de gènes PCR Expression de gènes PCR T7 5’3’ 5’ Séquence de la T7 polymérase 3’5’ 3’ 5’ Primer sens 3’5’ 3’ 5’ Primer antisens

42 Expression de gènes Transcription in vitro Expression de gènes Transcription in vitro 5’3’ 5’ Séquence de la T7 polymérase 5’3’ ARN sens Transcription in vitro en présence de T7 polymérase

43 Expression de gènes Adressage des sondes et Hybridation Expression de gènes Adressage des sondes et Hybridation Sonde de capture 3’ 5’ G ARN

44 Expression de gènes Incorporation de Cy5-ddCTP et détection du signal Expression de gènes Incorporation de Cy5-ddCTP et détection du signal 3’ 5’ G Cy5-ddCTP 3’ 5’ G C

45 Applications spécifiques Applications spécifiques Analyte Specific Reagents Analyte Specific Reagents Kits diagnostic moléculaire commercialisés Muco-viscidose (25 mutations) Hémochromatose Héréditaire (3 mutations ) Thrombose (2 mutations) Surdité Héréditaire (8 mutations) Maladie d’Alzheimer (2 mutations )  - Thalassémie (8 mutations)

46 Applications individuelles Parcs Nanogen ® installés Europe Applications individuelles Parcs Nanogen ® installés Europe Autres Applications

47 Applications individuelles

48

49

50 Autres applications potentielles  Toute application faisant appel à l’hybridation moléculaire  Interactions protéine / protéine  Immunologie, avec l’utilisation d’anticorps biotynilés adressés sur la biopuce …

51 Corinne Lacquemant Mob. 06 88 89 56 69 E-mail: c.lacquemant@ivagen.com Contact