Chapitre 7 Génie biologique titre Partie 3 Lutte Anti-bactérienne

plan 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 1. Les agents physiques. 3.1. Définitions. 1.1. La température. 3.2. Classification. 1.2. Les radiations. 3.3. Mécanismes d’action. 1.2.1. Les U.V. 3.3.1. les cibles des antibiotiques. 1.2.2. La radioactivité. 3.3.2. Action sur la paroi: Pénicilline. plan 1.3. Les méthodes mécaniques. 3.3.3. Action sur la membrane: polymyxine . 3.3.4. Action sur les acides nucléiques. 2. Les agents chimiques. 3.3.5. Action sur la synthèse des protéines. 2.1. Généralités. 4. La résistance aux antibiotiques. 2.2. Paramètres d’efficacité. 4.1. Le phénomène. 2.2.1. Mesure de la C.M.I. 4.2. Mécanisme. 2.2.2. Mesure de la C.M.B. 2.3. Classification. 4.2.1. Diminution de la perméabilité. 4.2.2. Dégradation de l’antibiotique. 4.2.3. Modification de la cible. 4.3. Origines de la résistance.

Cinétique de destruction thermique 1. Les agents physiques. 1.1. La température. 1.1 On a vu au chapitre 7-1 l’effet de la température sur la croissance microbienne. Cet effet est le reflet de l’action de la température sur les enzymes de la cellule. Plus l’enzyme est exposée longtemps à la chaleur, plus elle se dénature et perd son activité. Cinétique de destruction thermique tps d’exposition Activité enzymatique 37°C 40°C 44°C PLAN 3

1.1 1. Les agents physiques. 1.1. La température. La chaleur est utilisée comme méthode de décontamination. 1.1 Il existe de nombreuses techniques adaptées à des situations différentes. Traitement des déchets On détruit le substrat avec les contaminants. * Incinération. On utilise de fortes températures (180°C) pour le matériel résistant. * Four (chaleur sèche). On utilise la vapeur sous pression pour réduire la température (110°C) pour les milieu de culture * Autoclave (chaleur humide). La congélation permet de freiner ou de stopper la croissance bactérienne mais pas d’éliminer les contaminants. * Basse température. PLAN 4

1.2.1 1. Les agents physiques. 1.2. Les radiations. 1.2.1. Les U.V. L’ADN cellulaire absorbe les hauts niveaux d’énergie, principalement à 254 nm, de la lumière UV. Cette absorption d’énergie UV forme de nouvelles liaisons entre thymines adjacentes et forme des dimères.  Dimère de thymine L’excision et la réparation des séquences touchées provoquent des erreurs et induisent des mutations. La plupart d’entre elles sont létales. PLAN 5

1.2.2 1. Les agents physiques. 1.2. Les radiations. 1.2.2. La radioactivité. 1.2.2 Les rayonnements à haute énergie provoquent des cassures des brins d’ADN et des altérations de bases azotées. Seuls des rayons bêta d'énergie suffisante comme ceux du strontium-90 atteindront la couche la plus profonde de la peau (le subcutis). Ces effets sont aussi ressentis par les humains ce qui nécessitent de grandes précautions d’utilisation. La peau peut être bombardée par des rayonnements alpha ou bêta, soit en raison de la radioactivité de l'atmosphère (tritium, carbone-14), ou par accident si l'on touche une surface contaminée par la radioactivité. Des bêta moins énergiques comme ceux du carbone-14 pourront atteindre le derme. Les bêta du tritium (de très faible énergie) et les alpha car ils sont très vite arrêtés (une cinquantaine de microns) ne dépassent pas l'épiderme. Le contact avec une source radioactive, surtout alpha, occasionne des brûlures. PLAN 6

1.3 1. Les agents physiques. 1.3. Les méthodes mécaniques. Elle s’applique aux milieu fragiles qui ne supportent pas la chaleur. La filtration permet de séparer grandes et petites particules. Les randonneurs utilisent cette technique en Asie ou en Afrique. La centrifugation obéit au même principe mais l’absence de séparation entre culot et surnageant limite son efficacité. Notre séquence Télé à chat Ultraléger et adapté aux routards : 65 g seulement. Compact, il tient dans la paume de la main, facile à boire avec un débit de 1,7 l/min et facile à nettoyer pour lui prolonger sa durée de vie 35 € PLAN 7

Stoppe le développement 2. Les agents chimiques. 2.1. Généralités. 2.1 On parle d’agents chimiques pour les produits d’usages externes. bactéricide Le spectre +/- large algicide germicide fongicide bactériostatique Stoppe le développement Actions variées bactéricide Tue les bactéries bactériolytique Lyse les bactéries N Bactéries totales Bactéries vivantes PLAN 8

2.1 2. Les agents chimiques. 2.1. Généralités. Antiseptiques Usage sur tissus vivants désinfectants Usage sur matière inerte Conservateurs alimentaires Additif alimentaire Les propriétés des conservateurs alimentaires: bactéricide plutôt que bactériostatique action sur levures et champignons action sur germes pathogènes et germes produisant des altérations ne pas favoriser de résistance inoffensifs pour le consommateur et ne pas diminuer la qualité nutritive et gustative des aliments Stable, ne pas être dégradé par les germes présents dans l’aliment PLAN 9

2.2.1 2. Les agents chimiques. 2.2. Paramètres d’efficacité. C.M.I. Concentration minimale inhibitrice. Plus petite concentration qui empêche le développement bactérien. 2.2. Paramètres d’efficacité. 2.2.1 2.2.1. Mesure de la C.M.I. * Méthode en tubes Agent chimique 1 mol.L-1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 On prépare une gamme de l’agent chimique. On ensemence chacun des tubes. PLAN 10

Ces dosages s’appliquent aux antibiotiques 2. Les agents chimiques. C.M.I. Concentration minimale inhibitrice. Plus petite concentration qui empêche le développement bactérien. 2.2. Paramètres d’efficacité. Ces dosages s’appliquent aux antibiotiques 2.2.1 2.2.1. Mesure de la C.M.I. * Méthode en tubes Bactéries tests 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 On prépare une gamme de l’agent chimique. C.M.I. = 10-4 mol.L-1 On ensemence chacun des tubes. On incube et on note la présence de pousse. PLAN 11

Plus on s’éloigne du puits, plus la concentration est faible. 2. Les agents chimiques. Plus on s’éloigne du puits, plus la concentration est faible. 2.2. Paramètres d’efficacité. 2.2.1 2.2.1. Mesure de la C.M.I. Plus le diamètre est grand, plus le produit est efficace (il inhibe la croissance bactérienne à faible concentration). * Méthode en gélose On coule une gélose dans une boîte de Pétri. Diamètre critique On ensemence la surface avec une bactérie test. On creuse un puits. On verse la solution à tester. La solution diffuse et forme un gradient autour du puits. On observe la pousse autour du puits. PLAN 12

Plus on s’éloigne du puits, plus la concentration est faible. 2. Les agents chimiques. Plus on s’éloigne du puits, plus la concentration est faible. 2.2. Paramètres d’efficacité. 2.2.1 2.2.1. Mesure de la C.M.I. Plus le diamètre est grand, plus le produit est efficace (il inhibe la croissance bactérienne à faible concentration). * Méthode en gélose C La diffusion d’un soluté obéit à une équation complexe. La variation de concentration décrit une courbe. A chaque diamètre d’inhibition, correspond une concentration. Ces valeurs sont données dans des tables de référence. PLAN 13

2.2.2 2. Les agents chimiques. 2.2. Paramètres d’efficacité. C.M.B. Concentration minimale bactéricide. Plus petite concentration qui laisse 0,01% de survivants. 2.2. Paramètres d’efficacité. 2.2.2 2.2.2. Mesure de la C.M.B. La mesure se déroule en même temps que la détermination de la CMI. On a besoin de connaître la concentration de la souche test. Agent chimique 1 mol.L-1 Bactéries tests 10-1 10-5 10-6 10-7 10-2 10-3 10-4 C.M.B. = 10-3 mol.L-1 J1 J2 Numérations 107 bact.mL-1 10 bact.mL-1 103 bact.mL-1 107 bact.mL-1 107 . 0,0001 = 103 PLAN 14

2.3 2. Les agents chimiques. 2.3. Classification. On classe les agents anti-microbiens selon deux caractéristiques: 2.3 altération, solubilisation des membranes. Le mode d’action Dénaturation, inactivation protéine. Effet mutagènes, modification des acides nucléiques. Phénol Solubilisation des membranes Alcool Dénaturation des protéines Oxydants Altération des ponts disulfures La nature chimique Métaux lourds. Précipitation des protéines. Savons et détergents Solubilisation et élimination mécanique Colorants Altération ADN / ARN Agents alkylants Altération des ponts disulfures et ADN PLAN 15

2.3 2. Les agents chimiques. 2.3. Classification. Les essences naturelles sont des composés volatils présents chez quelques espèces végétales. essence eucalyptus voie respiratoire Les essences naturelles essence de thym voies intestinale et digestive Composés phénoliques + alcools + aldéhyde essence de santal voie urinaire PLAN 16

3.1 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.1. Définitions. - Sulfamides Agent chimiothérapeutique: Composé chimique naturel (antibiotique) ou de synthèse, à pouvoir bactéricide ou -statique. - Antibiotiques - Agents anti-viraux PLAN 17

3.1 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.1. Définitions. perturbent synthèse paroi bactérienne. 3.1 Agit sur les bactéries, inoffensif pour l’hôte (eucaryote). bloquent activité des ribosomes bactériens (différents des eucaryotes). Toxicité sélective inhibent synthèse acide folique (les eucaryotes ne le synthétisent jamais et se le procure dans l'alimentation). spectre large: cible = plusieurs groupes de micro-organismes (Gram+/-, ...) Nombre d'espèces ou types d'organisme attaqués par l’agent. Spectre d'action spectre étroit: cible = 1 seul groupe (Gram+, Gram-, ...) - Inoffensif: limiter toxicité sur foie, rein, allergie,... Innocuité pour l'hôte - Stables: pas d'hydrolyse ou de fixation sur les protéines plasmatiques. - Solubles dans liquides de l'organisme. PLAN 18

3.2 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.2. Classification. paroi Perturbe la synthèse. membrane Perturbe les échanges. Erreurs de lecture pendant la transcription ADN Formation liaisons covalente dans double hélice. Perturbe la transcription -----> erreurs de transcription -----> bloque ARN polymérase Synthèse protéines Perturbe la traduction. -----> inhibe les ribosomes. Métabolisme intermédiaire Analogues de substrat (inhibition compétitive) PLAN 19

3.3.1 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.3. Mécanismes d’action. * Inhibition des enzymes par changement de conformation (INC) 3.3. Mécanismes d’action. 3.3.1 3.3.1. les cibles des antibiotiques. PLAN 20

Voir le cours de première sur la paroi bactérienne. 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.3. Mécanismes d’action. 3.3.2 3.3.2. Action sur la paroi: Pénicilline. Noyau b-lactame * Pénétration par les porines membranaires Ce sont les enzymes bactériennes qui hydrolyse les liaison des peptides de jonction avant l’extension. * Fixation sur les carboxylases et les transpeptidases * Inhibition des enzymes par changement de conformation (INC) Voir le cours de première sur la paroi bactérienne. PLAN 21

Elle perturbe la perméabilité membranaire. 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.3. Mécanismes d’action. 3.3.3 3.3.3. Action sur la membrane: polymyxine . La polymyxine s’insère dans les membranes et crée des pores artificiels. Elle perturbe la perméabilité membranaire. PLAN 22

rifampicine (bactéricides) 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.3. Mécanismes d’action. 3.3.4 3.3.4. Action sur les acides nucléiques. Quinolones, acide nalidixique, ciprofloxacine, acide oxolinique (bactéricides) Inhibiteurs de la synthèse et de la fonction de l'ADN Mode d’action: Ces antibiotiques se lient à la sous-unité A de l’ADN gyrase (topoisomérase) et prévient le surenroulement de l’ADN, inhibant ainsi sa synthèse. Rifampine, rifamycine, rifampicine (bactéricides) Inhibiteurs de la synthèse et de la fonction de l'ARN Mode d’action Ces antimicrobiens se lient à l’ARN polymérase DNA-dépendante et inhibent l’initiation de la synthèse de l’ARN. PLAN 23

3.3.5 3. Les agents chimiothérapeuthiques. 3.3. Mécanismes d’action. Streptomycine, Kanamycine, gentamicine, tobramycine, amikacine, netilmicine, et néomycine (bactéricide) 3.3. Mécanismes d’action. 3.3.5 3.3.5. Action sur la synthèse des protéines. Inhibiteurs de la traduction au niveau du ribosome. Acide fusidique (bactériostatique) Se fixe sur 30S 30 S Bloque facteur d’élongation Tétracycline, minocycline et doxycycline (bactériostatique) Bloque le site A Spectinomycine  50 S Bloque fixation ARNm Erythromycine (bactériostatique)   Chloramphénicol, lincomycine, clindamycine (bactériostatique)   Bloque translocation Bloque peptide transférase PLAN 24

4.1 4. La résistance aux antibiotiques. 4.1. Le phénomène. www.inserm.fr 4.1. Le phénomène. 4.1 L’efficacité des antibiotiques s’est accompagnée de leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale. Ce phénomène a permit de sélectionner des bactéries résistantes contre ces antibiotiques. On parle de pression de sélection. La mauvaise utilisation des antibiotiques, passant par des traitements trop courts ou trop longs, en est la première responsable. Les animaux sont de gros consommateurs d’antibiotiques. Or, comme chez l’Homme, la surconsommation d’antibiotiques dans les élevages est responsable de l’apparition de résistances. Les bactéries multi-résistantes issues des élevages peuvent se transmettre à l’Homme directement ou via la chaîne alimentaire. La majorité des cas de résistances aux antibiotiques est retrouvée à l’hôpital, où environ la moitié des antibiotiques consommés par l’Homme en France est utilisée. Des résistances surviennent aussi en ville, au détour d’antibiothérapies « apparemment anodines » : sous la pression d’un banal traitement antibiotique par voie orale,  PLAN 25

4.1 4. La résistance aux antibiotiques. 4.1. Le phénomène. www.inserm.fr 4.1. Le phénomène. 4.1 Certaines bactéries sont naturellement résistantes à des antibiotiques. On parle de résistance innée. Leur patrimoine génétique les rend insensibles à un certain nombre d’agents. C’est par exemple le cas des Escherichia coli vis-à-vis de la vancomycine, ou encore de Pseudomonas aeruginosae face à l’ampicilline. Plus préoccupant, le phénomène de résistance acquise entraine l’apparition subite d’une résistance à un ou plusieurs antibiotiques auxquels la bactérie était auparavant sensible.  Ces phénomènes de résistance surviennent dans tous les pays du monde et sont particulièrement importants dans les pays où les niveaux d’hygiène sont faibles. Il existe un véritable gradient nord-sud, avec des taux plus faibles dans les pays du Nord.  PLAN 26

4.1 4. La résistance aux antibiotiques. 4.1. Le phénomène. www.inserm.fr 4.1. Le phénomène. 4.1 Pour faire face à cette situation, l’idée n’est pas de trouver une solution permettant d’éviter l’apparition de résistances, car les bactéries trouveront toujours un moyen de s’adapter. Il convient plutôt de préserver le plus longtemps possible l’efficacité des antibiotiques disponibles. Des mesures élémentaires comme le lavage systématique des mains en sortant des toilettes restent fondamentales pour éviter la diffusion d’entérobactéries résistantes. Réduire la consommation d’antibiotiques La consommation de ces médicaments a chuté de 16 % entre 2000 et 2009. La France reste cependant parmi les plus gros utilisateurs, et la consommation est légèrement repartie à la hausse depuis 2009. Nouveaux antibiotiques Les incitations publiques à une moindre consommation ont découragé les laboratoires pharmaceutiques d’investir dans cette voie  Autres voies thérapeutiques * l’inhibition de l’action des enzymes qui les rendent les bactéries résistantes * Les thérapies « antivirulence ». bloquer les systèmes qui rendent la bactérie pathogène pour l’Homme. Des antitoxines dirigées contre certaines toxines bactériennes sont à l’étude. * La phagothérapie  consiste à éliminer les bactéries grâce à des phages.  PLAN 27

4.2 4. La résistance aux antibiotiques. 4.2. Mécanisme. Pénétration grâce à une porine. 4.2 L’action des antibiotiques se déroule en deux étapes. Fixation sur une cible. AB AB hydrolyse AB pompage Blocage des porines. La résistance agit à tous les niveaux. Elimination de l’antibiotique. PLAN 28 Modification de la cible.

4.2.1 4. La résistance aux antibiotiques. 4.2. Mécanisme. 4.2.1. Diminution de la perméabilité. Ce mécanisme n'affecte pas les "Gram positifs" car les antibiotiques diffusent librement à travers le peptidoglycane qui constitue la paroi de ces bactéries. Chez les bactéries à Gram négatif, au contraire, la barrière constituée par le lipopolysaccharides (LPS) de la membrane externe s'oppose à la pénétration des antibiotiques et ceux-ci doivent emprunter des porines pour passer la barrière membranaire. Les mutations entraînant des modifications quantitatives ou qualitatives des porines sont responsables de résistances acquises souvent croisées à plusieurs familles d'antibiotiques. Elles sont constatées chez les entérobactéries (E.coli, P.mirabilis, E.cloacae, Salmonella, Serratia), chez les Pseudomonas, Haemophilus et Neisseria gonorrheae. PLAN 29

L’enzyme est la b-lactamase. Staphylococcus aureus 4. La résistance aux antibiotiques. 4.2. Mécanisme. 4.2.2 4.2.2. Dégradation de l’antibiotique. Les antibiotiques sont le substrat d’enzymes de dégradation. Il existe un grand nombre de cas différents. Le plus emblématique est celui de la pénicilline. L’enzyme est la b-lactamase. Noyau b-lactame Chez les Gram + Staphylococcus aureus Elles sont présentes: Chez les Gram - Haemophilus, Pasteurella, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas PLAN 30

4.2.3 4. La résistance aux antibiotiques. 4.2. Mécanisme. 4.2.3. Modification de la cible. Modification par mutation. * Les enzyme de synthèse de la paroi. Surproduction de l’enzyme. Résistances mutationnelles (staphylocoques, entérocoques) ou acquises par transformation (Pneumocoques) * Les ribosomes. Modification par mutation.  Résistances aux tétracyclines, aux macrolides et lincosamindes, au phénicoles, à la fucidine et plus rarement aux aminosides. la gyrase. * La synthèse des acides nucléiques. Modification par mutation de la transcriptase.  Résistances naturelles de Enterococcus faecalis, Acinetobacter, Neisseria, Pseudomonas, Mycobacterium, Enterococcus les enzymes de synthèse de l’acide folique. PLAN 31

4.3 4. La résistance aux antibiotiques. La résistance est le résultat de l’apparition d’un gène qui procure de nouvelles propriétés à la bactérie. 4.3. Origines de la résistance. 4.3 2 supports du génotype: Chromosomique. Les mutations sont ponctuelles et ne concernent qu’un individu. En présence d’antibiotique, la bactérie résistante est la seule à survivre et devient l’espèce prédominante. On parle de sélection ou de pression sélective. Plasmidique. Les plasmides portent des gènes de résistance (souvent plusieurs) et peuvent se transmettre d’une bactérie à une autre (pas forcément de la même espèce) par conjugaison. C’est le type même de la résistance acquise et est responsable des multi-résistances. PLAN 32