CM2 Molécule non isolé: Effet de l’environnement sur la fluorescence Fluorescence polarité Liaison hydrogène pH pression viscositétempérature Chocs moléculaires ions Potentiel électrique

Réponse: L’absorption de lumière =un phénomène rapide ( s),  les spectres d’absorption sont peu sensibles au phénomène de diffusion et à la dynamique moléculaire. Seul l’environnement immédiatement adjacent aux chromophores peut affecter les spectres d’absorption. Q. Pourquoi la fluorescence est sensible l’environnement? la fluorescence =phénomène plus lent (temps de vie typique = 10ns),  l’environnement pouvant influer sur le spectre d’émission de fluorescence est plus large.

Rappels: - Coefficient d’extinction ou absorbance spécifique  :Reflète la probabilité d’absorption d’une molécule - brillance = ε.   Q. Quelles situations où diminution de l’ intensité de fluorescence I f ? I f ≈ 2,3  f. I o. ε. C. l (Io = intensité lumineuse incidente) tout phénomène qui diminue ε,  f Ou diminution de la concentration c en fluorophore X : Réponse: I f ≈ 2,3  f. I o. ε. C. l

Émission de fluo phosphorescence Fluorescence retardée (non vue en cours) Croisement intersystème X état fondamental Conversion interne interactions à l’état excité ou à l’état fondamental: Molécule excitée 1 X* Transfert d’énergie non radiatif Cf.FRET Complexes à l’état excité cf -excimère,exciplexes -quenching collisionnel Transfert de charge intramoléculaire Cf. certaines sondes de potentiel Molécule isolée Transformation chimique Cf. photobleaching cf FRAP Etc… Molécule NON isolée -Complexe à l’état fondamental -Solvatation  cf. effet du solvant sur spectre d’absorption -Réaction à l’état fondamental

I. FRET = Förster resonance energy transfer ou fluorescence resonance energy transfer (aussi connu sous terme resonance energy transfer (RET) ou electronic energy transfer (EET)) = Méchanisme décrivant le transfert d’énérgie entre deux chromophores « A donor chromophore, intially in its electronic excited state, may transfer energy to an acceptor chromophore (in close proximity, typically <10nm) through nonradiative dipole- dipole coupling. This mechanism is termed "Förster resonance energy transfer" and is named after the German scientist. When both chromophores are fluorescent, the term "fluorescence resonance energy transfer" is often used instead, although the energy is not actually transferred by fluorescence. In order to avoid an erroneous interpretation of the phenomenon that (even when occurring between two fluorescent chromophores) is always a nonradiative transfer of energy, the name "Förster resonance energy transfer" is preferred to "fluorescence resonance energy transfer" - although the latter enjoys common usage in scientific literature. » Ne pas confondre avec un processus de transfert d’énergie radiatif

Le recouvrement spectral entre les spectre d’émission du et le spectre d’absorption de l’ accepteur: Intensity Wavelength Absorbance DONOR Absorbance Fluorescence ACCEPTOR Molecule 1Molecule 2

FRET= Transfert d’énergie entre le donneur et l’accepteur NON radiatif car cela ne se fait PAS par échange de photon: Ne pas confondre avec un processus de transfert d’énergie radiatif

L’efficacité de transfert de FRET (E) =rendement quantique de la transition par transfert d’ energie, i.e. la fraction d’énergie transférée lors de l’événement par nombre d’ événements d’excitation du donneur: Retenir que l’efficacité E du FRET dépend de trois paramètres : 1. la distance r entre le donneur et l’accepteur 2. Le recouvrement spectral entre les spectre d’émission du et le spectre d’absorption de l’ accepteur 3. L’orienation relative des moments dipôlaires d’émission du donneur et d’absorption de l’ accepteur. (1+ r/R 0 ) 6 E= 1 avec R 0 = distance de Förster distance de cette paire doneur - accepteur pour lequel E = 50%.

Deux grandes familles de techniques basées sur le FRET : 1/ celles fondées sur la mesure de la quantité de fluorescence transférée entre un donneur et un accepteur (FRET proprement dit) 2/ celles fondées sur la mesure du déclin de fluorescence du donneur ou de l’accepteur (FLIM, fluorescence lifetime imaging microscopy). Exemples d’applications: - interactions intermoléculaires (récepteur-ligand) OU intramoléculaires (repliement de l’ADN, structure quaternaire d’une protéine)/ séquençage de l’ADN -Utilisations de variants de GFP qui servent de bio-capteurs d’ions ou de molécules à doser (AMPc, par exemple) directement dans une cellule unique.

Exemple de FRET intramoléculaire Ordre de grandeur: ≈70 Å selon la géométrie des molécules et du système d’observation

II. Quenching de fluorescence X + Q X-Q X-Q + h pas de fluorescence X* + Q X + Q+ chaleur X + h 1 X* - Quenching statique - Quenching Collisionel ( = quenching dynamique) : - Deux mécanismes de Quenching: Formation d’un complexe à l’état fondamental) formation d’un complexe à l’état excité

Exemples de quenching collisionel (dynamique) L’oxygène mol é culaire ( 3 O 2 ) quenche la majorit é des fluorophores M é chanisme : X + h 1 X* 1 X* + 3 O 2 3 X* + 1 O 2 3 X* X + chaleur Les Amines quenchent les hydrocarbones aromatiques Méchanisme (exemple: A = Anthracène): X + h 1 A* 1 A* + R 3 N [A- +NR 3 ] [A- +NR 3 ] A + R 3 N + chaleur Autres quenchers: a) Composés avec des atomes lourds (l 3 CCH2OH: facilite l ’ ISC vers l ’é tat triplet) b) Les accepteurs d ’ electrons (Cu2+, Mn2+, NO3-): acceptent un electron de X*) etc …

Exemple de Quenching statique

Equation de Stern-Volmer F 0 /F = 1 + k d [Q] La Comparaison de l’efficacité de quenching à deux températures différentes permet d’identifier quel catégorie de quenching est en jeu: Higher temperature; Collisional quenching Higher temperature; Static quenching F 0 /F [Q], mole/L équation valable pour les deux catégories de quenching (statique et collisionel) À haute température -la vitesse de diffusion augmente  Le quenching collisionel est plus efficace - le complexe formé entre le fluorophore et le quencher est déstabilisé  Le quenching statique est moins efficace F 0 = intensité de fluorescence lorsque fluorophore seul F = intensité de fluorescence en présence de Q (diapo pas au programme du parcours bio)

Applications: sonde de pH La protonation ou la déprotonation de groupes fonctionnels modifient de nombreux fluorophores, -Soit au niveau de leur rendement quantique -Soit au niveau des spectres d’excitation ou d’émission. III. Influence du pH sur la fluorescence IV. Polarité La polarité peut jouer sur l’absorption (  et exc) Mais aussi au niveau de la fluo sur em de fluorescence et I f:

« photobleaching » (photoblanchiment) =destruction irréversible d’un fluorochrome excité par la lumière en présence d’oxygène. «fading »= diminution de fluorescence sur une longue période sans nécessairement d’excitation lumineuse (simple oxydation) 1/ Utiliser des « quenchers » pour réduire la concentration d’oxygène: -Agents anti-oxydants: DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) ou parapenylene diamine -utiliser des milieux de montage avec anti-fading 2/ Atténuer l’intensité lumineuse excitatrice 3/Augmenter la vitesse de balayage en microscopie confocale ou diminuer le temps d’illumination en microscopie plein champ (obturateur rapide, temps d’exposition diminué, rapidité del’acquisition en Z… 4/ quantum dot Comment limiter le photoblanchiment ou le « fading »? V. Photobleaching et fading (cf cours sur problèmes rencontrés en microscopie)

Binding, Dissociation et FRAP: Proteines dans structure: Exemples: formes Dimères ou interaction avec cytosquelette etc) Before Photobleaching Binding (k + ) Dissociation (k - ) Protéines libres Utilisation volontaire du photobleaching: technique du FRAP =Fluorescence Recorvery After Photobleaching « Bleaching » = photoblanchiment Exemple: protéine fluorescente

Binding, Dissociation et FRAP: Binding (k + ) Dissociation (k - ) Protéines libres « Bleaching » = photoblanchiment après Photobleaching (irradiation localisée destructrice de X)

Partial fluorescence Recovery Si Proteines dans structure: Exemples: formes Dimères ou interaction avec cytosquelette etc)  l’échange sera plus difficile Binding, Dissociation et FRAP:

Résultats typique obtenus:

La technique de FRAP est donc particulièrement bien adaptée à la mesure du trafic et des mouvements dans et entre les compartiments cellulaires. Résultats obtenus par le FRAP Deux grandeurs importants : 1. La valeur de la fraction mobile est influencée par les interactions d’une protéine fluorescente avec d’autres molécules ou une membrane (des microdomaines lipidiques par exemple vont limiter les mouvements d’une protéine). Le temps de diffusion est proportionnel à la constante de diffusion (D) qui dépend elle-même des propriétés hydrodynamiques de la molécule observée et de son environnement (c’est- à-dire du milieu cellulaire).

VI. Que se passe t-il si la solution de X est trop concentrée? On a vu en TP que la DO (spectre d’absorption est n’est plus linéaire passé une certaine concentration…de même pour l’intensité de fluo: Excimères (cf notes de cours)