STRUCTURE et DETERMINATION des Ag HLA RECHERCHE d’Ac ANTI-HLA TECHNIQUES DE CROSS-MATCH Diplôme Inter Universitaire de Transplantation d’Organes Coordonnateur Pr Y. Lebranchu Faculté de Médecine, Tours 07/01/09 Dr I. Jollet, Labo HLA Poitiers Merci à C. Suberbielle et à M. Abbal

Le travail du labo HLA en transplantation d’organe Typage HLA en urgence du donneur Patient en bilan pré greffe Greffe Suivi post greffe CGR Recherche et étude d’Ac anti HLA Sérothèque XM sur sérum du jour et histo Biothèque Typage HLA Échanges avec cliniciens / Recueil des informations médicales +++ ATCD immunisants (Tf, grossesses, greffes, détransplantations)

1. STRUCTURE et DETERMINATION des Ag HLA (Typage HLA)

Rappels : POLYMORPHISME du système HLA - polygénique (gènes HLA -A, -B, Cw, DR, DQ, DP) - polyallélique (allèles HLA A*0101, *0102, ….) - à expression codominante : les allèles hérités des 2 parents s’expriment A B Cw DR DQ DP - En théorie : plus de 10 milliards de combinaisons possibles ! - En fait : Fréquences alléliques variables Transmission en bloc de parent à enfant Déséquilibres de liaison

Typage HLA Caractérisation des Antigènes HLA A B Cw DR DQ DP Réactions Ag - Ac Caractérisation des Allèles HLA Biologie Moléculaire

Caractérisation des molécules HLA (Antigènes) par des Anticorps : Rappels Les Ac reconnaissent des d’épitopes (structure 3D de quelques Acides Aminés) ( 2 molécules HLA codées pas des allèles très différents peuvent être reconnues par un même Ac : réactions croisées) Epitope : groupe d’AA pas forcément linéaires Accessibilité variable des différentes zones de la molécule HLA Epitopes publics (partagés par plusieurs molécules HLA ) / privés Les Anticorps utilisés : Poly ou monoclonaux Source « artisanale » ou commerciale Poly ou mono spécifiques Isotype, affinité variables

Caractérisation des molécules HLA : Technique Sérologique 1954 : J. Dausset : leuco agglutination 1964 : P. Terasaki : micro Lympho Cyto Toxicité (LCT) Complément dépendante (« CDC ») 1. Isolement des cellules mononucléées à partir du sang total par Ficoll 2. Contrôle de la viabilité et ajustement de la concentration cellulaire 3. Dépôt des CMN en plaques de Terasaki (chaque puits contenant des Ac ani HLA de spécificité connue) FEDCBA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4. Ajout de complément 5. Ajout de colorant vital

LCT : Micro Lympho Cyto Toxicité Complément dépendante Principe (1) Cellule HLA A2 Cellule HLA A3 Ac anti HLA A2

LCT : Micro Lympho Cyto Toxicité Complément dépendante Principe (2) Cellule HLA A2 Cellule HLA A2 Cellule HLA A3 Ac anti HLA A2 Ac anti HLA A2 Complément Ac anti HLA A2 Ac anti HLA A2

LCT : Micro Lympho Cyto Toxicité Complément dépendante Principe (3) Cellule HLA A2 Cellule HLA A3 Colorant vital Ac anti HLA A2 Ac anti HLA A2 Ac anti HLA A2 Ac anti HLA A2

Lecture et interprétation LCT : Micro Lympho Cyto Toxicité Complément dépendante Lecture et interprétation A B C D E F 1 2 3 4 5 6 7 8 9 HLA A 1, 25 8 1

Exemple : 21 Ag A A 2 A 30 B 15 46 Ag B B 18 Cw DR 13 DR 3 10 Ag Cw Le polymorphisme HLA vu sous l’angle de la LCT A 2 A 30 B 15 B 18 Cw DR 13 DR 3 DQ 6 DQ 2 DP Exemple : 21 Ag A 46 Ag B 10 Ag Cw 19 Ag DR 9 Ag DQ 6 Ag DP « Splits » et « Broads »

Particularités (1) En LCT : Broad / Splits - Large/ Sous types A9 : A23 A24 B17 : B57 B58 DR2 : DR15 DR16 Groupes de réaction croisée A1: A1 A3 A11 A36 A2: A2 A28(68-69) A9(23-24) B17 A19: A29 A30 A31 A32 A33 A74 B7: B7 B54 B55 B27 B42 B60 B61 B13 B47 B41 B5: B5(51-52) B53 B35 B18 B78 B15 B70 ……

Particularités (2) Haplotypes conservés A2 B44 A1 B8 DR3 Déséquilibre de liaison DR17 DQ2………….DR7 DQ2 DR18 DQ4………….DR8 DQ4 Co-expression possible en DR de 2 chaînes b une a DR51 : DR15 DR 16 (DR2) DR53: DR4 DR7 DR9 DR52: DR3(17-18) DR5 (11-12) DR6(13-14) Rien : DR1 DR10 DR8

Caractérisation des Antigènes HLA Typage HLA Caractérisation des Antigènes HLA A B Cw DR DQ Réactions Ag - Ac DP Caractérisation des Allèles HLA Biologie Moléculaire

Le polymorphisme HLA vu sous l’angle de la BM ... 01 02 07 03 05 12 04 14 Pb de nomenclature !!!! A 2 A 30 B 15 B 18 Cw DR 13 DR 3 DQ 6 DQ 2 DP

Découverte incessante de nouveaux allèles 1996 82 71 (B1) 27 (B1) 166 (B1) 38 174 Janvier 2009 695 95 602 381 1108 268

Quelques notions de nomenclature HLA (1) HLA A 2 Antigène Typage par technique Sérologique Allèle HLA A* 02 HLA A* 0205 Typage par Biologie Moléculaire Niveau générique (« 2 digits ») Niveau spécifique (« 4 digits »)

Quelques notions de nomenclature HLA (2) La précision de typage dépend de la technique utilisée HLA A* 02 Niveau générique (« 2 digits ») Niveau de résolution intermédiaire HLA A* 0201/02 : A*0201 ou *0202 (02AB) HLA A* 0205 Niveau spécifique (« 4 digits »)

Techniques de typage HLA par Biologie moléculaire 1. Extraction de l’ADN (+/- automatisée) 2. Différents types de techniques, basées sur la PCR PCR SSO, PCR SSO Reverse, PCR SSP, Séquençage

Rappels : la Polymerase Chain Reaction PCR (1) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

Rappels : la Polymerase Chain Reaction PCR (2) 5’ 5’ 5’

Rappels : la Polymerase Chain Reaction PCR (3) 30 cycles : 106 copies Facteurs influençant le rendement : Prélèvement Qualité de l’extraction Choix des amorces Programme du thermocycleur

Autant de PCR que d’allèles à identifier Exemple de technique de typage par BM (1) PCR-SSP (Sequence Specific Primer) Principe (1) Amplification basée sur la sélection de couples de primers choisis dans les régions polymorphes Allèle x Allèle y Allèle z Autant de PCR que d’allèles à identifier

PCR-SSP : Principe (2) Allèle x Allèle y 5’ 5’ 3’ 3’ Pas d ’appariement 3’ Amorce spécifique de l’allèle x 5’ Amorce spécifique de l’allèle x 5’ Appariement 3’ Amplification Pas d’amplification

Révélation par électrophorèse PCR-SSP : Principe (3) Révélation par électrophorèse Allèle x Allèle  x Témoin interne

Tubes de D-Mix aliquotés Contrôle négatif Amorces lyophylisées + contrôle interne

Mode opératoire 1.Etape pré-PCR

2. PCR : environ 1h30

3. Electrophorèse

_ + 4. Lecture et Interprétation ContrôleNégatif puits bande positive + _ puits contrôle interne amorces

Logiciel d ’interprétation

Exemple de technique de typage par BM (2) : PCR SSO Reverse / technologie Luminex Billes coatées avec des sondes d’ADN, spécifiques de zones de polymorphisme Hybridation du produit de PCR rendu fluorescent avec les billes Lecture en CMF Luminex

Exemple de technique de typage par BM (3) : le Séquençage Détermination de la séquence nucléotidique Comparaison à une banque de données de toutes les séquences connues d ’allèles HLA

Choix de la technique - Typage HLA d’un receveur ou d’un donneur en 1ère intention : LCT (parfois difficultés d’assignation surtout pour la classe II) ou Biologie moléculaire 2 digits (PCR SSP en urgence) (pb d’ambiguïtés parfois) - Typage HLA Cw, DPB1, DQA1, Typage MICA… : BM - Typage pour recherche d’Ac spécifiques d’allèles : BM 4 digits

- Détermination du nombre d’incompatibilités Confrontation des typages donneur / receveur - Détermination du nombre d’incompatibilités R: A01 A02 B08 B44 DR03 DR04 D1: A01 A02 B08 B44 DR03 DR04 D2: A01 A29 B08 B44 DR03 DR04 D3: A01 A - B08 B44 DR03 DR04 6 Id 0 MM 5 Id 1 MM 5 Id 0 MM - Ces incompatibilités sont -t-elles des Ag permis ou interdits?

2. RECHERCHE d’Ac ANTI-HLA

Progrès techniques considérables depuis les débuts de la LCT Sensibilité Specificité 1964 2008 Intérêt - En pré greffe - En post greffe

Recherche et étude des Ac anti HLA en pré greffe : Pourquoi ? Transfusion Contact avec Ag HLA étrangers grossesse Risque d’apparition d’Ac anti HLA greffe Receveur Ac anti HLA A3 A3 Donneur de rein Rejet suraigu du greffon

Étude des Ac en bilan pré-greffe But : Arriver au CM en étant quasi certain de pouvoir greffer (CM Négatif ou positivité acceptable) Comment ? Établir la liste exhaustive des spécificités Ac du patient tout au long de son suivi Idéalement : catégoriser tous les Ag HLA en Ag « permis » ou « interdits » augmentation du nombre de greffons proposés diminution des CM « inutiles » (refus des greffons en amont)

Techniques d ’étude des Ac anti HLA LCT : Lymphocytotoxicité Complément Dépendante ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay CMF : Cytométrie en Flux / Luminex

Techniques d ’étude des Ac anti HLA LCT : Lymphocytotoxicité Complément Dépendante ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay CMF : Cytométrie en Flux / Luminex

LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante : Principe Ac anti HLA A2 Cellule HLA A3 Cellule HLA A2

LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante : Principe Cellule HLA A3 Complément Colorant vital Cellule HLA A2

LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante : Principe Panel de 40 lymphocytes T ... Ly1 Ly2 Ly3 Ly4 Ly5 Ly6 Sérums à étudier S1 S2 ... ... 40 plaques S1 S2 ...

S1 réagit avec 4/40 cellules du panel T : Ly1 LyT2 LyT3 LyT4 LyT5 LyT6 LyT1 S1 réagit avec 4/40 cellules du panel T : Taux d ’Ac anti HLA de classe I = 10% ... Ly2 : A3 A25 B44 B51 Ly1 : A1 A2 B8 B63 Ly3 : A30 A32 B51 B64 Ly4: A25 A2 B38 B49 Ly5 : A25 A3 B60 B8 Ly6 : A25 A34 B39 B62 Spécificité ? Ac anti A25 A3 ?

LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante : Principe (2) Panel de 30 lymphocytes B ... Ly1 Ly3 Ly4 Ly5 Ly6 Sérums à étudier S1 S2 Ac anti HLA de classe I et de classe II S1 S2 Adsorption sur pool de plaquettes Ly1 Ly2 Ly3 Ly4 Ly5 Ly6 ... Ac anti HLA de classe II Élimine Ac anti classe I

LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante : Principe (3) S1 : PRA = 10% IgG ou IgM ? Traitement au DTT PRA = 10% PRA = 0% IgG IgM

1. LCT : lymphocytotoxicité complément dépendante Avantages Inconvénients Technique de référence Robuste Test fonctionnel Lourdeur Peu standardisée (panel) Interprétation délicate Difficilement automatisable Pas très sensible Ne détecte pas que des Ac anti HLA Détecte IgG et IgM

Techniques d ’étude des Ac anti HLA LCT : Lymphocytotoxicité Complément Dépendante ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay CMF : Cytométrie en Flux / Luminex

Technique ELISA : principe Substrat de l’enzyme Molécules HLA purifiées Ac anti IgG couplé à une enzyme Ac anti HLA (IgG)

Technique ELISA : avantages, inconvénients par rapport à la LCT Rapide en screening Automatisable Relativement standardisée Interprétation facile en screening 3 niveaux : screnning/ identification / Haute Définition PRA non représentatif (ident.) Long en identification et HD Coût réactif Test non fonctionnel Pas de test à l’unité en screening utilisable en CM mais +/- en urgence Plus sensible Ne détecte que les Ac anti HLA Ne détecte que les IgG (sauf adaptation) Détecte toutes les IgG

Techniques d ’étude des Ac anti HLA LCT : Lymphocytotoxicité Complément Dépendante ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay CMF : Cytométrie en Flux / Luminex

Technique Luminex : prinicipe Schématiquement : même principe que l ’ELISA - Support différent (billes) - Signal fluorescent et détection par lasers Screening, Identification, Haute Définition

Technique Luminex : prinicipe

Luminex : avantages, inconvénients par rapport à l ’ELISA Plus rapide (identification) Plus modulable (série ou unité) interprétation parfois délicate Plus coûteuse + sensible

Technique ELISA / CMF/ Luminex : 3 niveaux d ’identification des Ac Fonction de la nature des molécules HLA purifiées Mélange de l’ensemble des molécules HLA de classe I ou II Screening Identification Molécules HLA de classe I ou II purifiées à partir d’une cellule (ex : DR1, DR15 ; DQ5, DQ6) Haute Définition Une molécule HLA de classe I purifiée (ex : DR1) Présence ou absence d ’IgG anti HLA (I ou II) Même mode d’interprétation que la LCT Si + : Ig G anti HLA de spécificité définie

Patiente : HLA A1, 32 ; B7, 52 Mari : HLA A3, 24 ; B27, 61 Ex : Luminex Haute Définition (« Single Antigen ») Mari : HLA A3, 24 ; B27, 61 Patiente : HLA A1, 32 ; B7, 52

En pratique : Combinaison des techniques au laboratoire Screening : Luminex ou ELISA Si pos : étude des spécificités : LCT : - Cl I (PRA Cristal), au moins une fois par an pour faire référence par rapport au XM - Cl II : compliqué +++ Techniques de SA : idéales mais chères +++ et pas de PRA Pb de sensibilité excessive ? Techniques sensibles : ELISA / CMF / Luminex Tenir compte du dossier +++ et importance du dialogue labo-cliniciens +++ Fondamental d’obtenir les sérums en fonction des événements potentiellement immunisants.

Les Ac anti HLA : paramètres à prendre en considération Cible : molécules HLA de classe I ou de classe II / Allo ou Auto Ac (généralement non anti HLA) Classe d’Ig : IgG, IgM, (IgA) / Ac fixant le complément ou non Spécificité (Réactivités croisées, épitopes (matchmaker …) Titre : corrélation avec la technique d’ étude et l’intensité des réactions, intérêt également lors des protocoles de désensibilisation, Histoire du sérum +++ : ancien ? Post événement ? T° d’action : 22°C, (37°C / 4°C) Affinité : variation dans le temps ?

Spécificité Ac : Ac NON Donneur spécifiques : Théorie des épitopes R : HLA DR 17 D : HLA DR 17, 15 Cai, Terasaki et al, Am J Transplant 2006

Etude des Ac anti HLA en post greffe : Intérêt grandissant ! Progrès grâce à outils techniques - C4d - Détection des Ac anti HLA (I et II) / non HLA Publications faisant le lien entre les données cliniques et l’utilisation de ces techniques : émergence du concept de rejet Ac médié Progrès thérapeutiques : action possible sur la composante humorale du rejet Questions d’actualité : Ac non HLA..

Pas vraiment de consensus ... En pratique ... Pas vraiment de consensus ... Mettre en balance rapport coût / bénéfice pour le patient Étude systématique ? Screening Ac anti HLA Cl I et II (+/- MICA) par Luminex ou ELISA : évalué à 50 euros Utile si protocole thérapeutique cohérent quand Ac détectés Ac non HLA, non MICA : difficile en routine

3. TECHNIQUES DE CROSS-MATCH

Cross-match pré greffe Épreuve de compatibilité tissulaire entre : Les sérums du receveur, conservés en sérothèque tout au long du suivi du patient Sérums du patient Sérothèque jour historiques Les cellules du donneur (PMO : lymphocytes isolés d’un échantillon de rate ou de ganglion : importance de la qualité de l’échantillon) Lymphocytes Totaux et / ou T +/- B (Sang si Donneur Vivant, Ganglion, Rate si donneur cadavarique) XM

- Sérum du jour (< 48 heures) : Quels sérums ? - Sérum du jour (< 48 heures) : - impératif si receveur a des Ac anti HLA - ou sérum < 3 mois si receveur non immunisé et pas d’événement sensibilisant intercurrent - Sérums « historiques » (variable selon les Centres) - pic(s) de PRA - post événements sensibilisants : transfusions, détransplantation ... - sérums présentant de nouvelles spécificités Ac

Quelle technique ? LCT « classique » : technique de référence, obligatoire Sérums testés - purs, éventuellement dilués - traités au DTT - Vis à vis des Ly totaux/ T et des Ly B En duplicate LCT « sensibilisée » ELISA CMF Luminex Techniques facultatives, augmentant la sensibilité

Cross match en LCT sensibilisée : principe Incubation des cellules du Donneur avec le sérum du patient Adjonction d’AGH (antiglobuline humaine : Ac anti chaîne Kappa) puis LCT classique (C’ et colorant vital) Potentialise la cytotoxicité

Cross-match en Cytométrie de flux Ac anti CD3: CXM T Ac anti CD19: CXM B Ac anti IgG humaine FITC Ac anti HLA Ag HLA CD3 Lymphocyte T Sérum Lymphocytes du donneur Analyse au cytomètre de flux Négatif Positif

CM utilisant des supports de fixation des cellules du donneur ELISA, Luminex Réalisation d’un lysat des cellules du donneur Puis capture des molécules HLA au fond d’un puits (ELISA) ou sur billes de polystyrène (Luminex) grâce à des Ac monoclonaux Puis technique ELISA ou Luminex classique Variante Luminex : sélection de billes SA correspondant au groupe tissulaire du donneur Pas ou peu utilisés en urgence mais utiles en CM rétrospectif

CM en LCT : Interprétation T B DTT Résultat + + + IgG anti HLA I +/- II Auto Ac - Ac non HLA + + - IgM Auto Ac - Ac non HLA Ac anti HLA I +/- II - + + IgG anti HLA I faible - HLA II Non HLA Auto Ac - + - IgM Auto Ac - Ac non HLA Ac anti HLA I faible – anti HLA II

Cross-match pré greffe (rénale) : interprétation Positif sur Ly T en LCT sur sérum du jour et IgG Pas de greffe Positif LCT sur Ly B seulement (Cf. rang de greffe) ou IgM ou Sérums « très historiques » ou Nég LCT, Pos technique sensible Fonction des équipes, du contexte, ... Greffe à discuter

Peut-on éviter le CM prospectif ? Les standards de l ’European Federation for Immunogenetics le prévoient … de façon très encadrée, et à condition de respecter la législation nationale en vigueur - Recherche Ac constamment négative chez le patient - sérums correctement prélevés (tous les 3 mois ou comme recommandé par l’organisation nationale / devraient être prélevés après chaque événement immunisant) - Sérums prélevés pendant au moins un an - sérums testés par au moins 2 techniques - au moins 1 sérum < 3 mois testé par une technique de sensibilité équivalente à celle du XM - vérification rétrospective et documentée de la négativité du XM - Preuves que le labo HLA soit au courant des événements sensibilisants et les trace - avertissement du clinicien si le XM est finalement positif - évaluation de cette pratique

En conclusion…. Travail du labo HLA en transplantation d’organe Techniques « artisanales » ou « modernes », en évolution constante Maillon indispensable pour la greffe Interactions importantes avec les cliniciens