Diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose : Détection de la mutation p.Phe508del par MEMO-PCR et analyse de fragments C. Gautier-Dubucs, interne en DES Génétique Médicale Pour le Laboratoire de Génétique Moléculaire (Pr M. Koenig) CHRU Montpellier – Université de Montpellier EA7204

Difficultés techniques Rappels : ADN fœtal circulant Difficultés techniques cffDNA Pat:Mat = 1:1 Pat:Mat = 1:20 Forte fragmentation Petits fragments (≈143 pb) Faible concentration ADN maternel prédominant: ratio 1/10-1/20 Forte homologie avec ADN maternel Difficile d’identifier une mutation portant sur un seul nucléotide

Difficultés techniques Applications actuelles Rappels : ADN fœtal circulant Difficultés techniques Applications actuelles Détection de séquences absentes dans le génome maternel: Détermination du sexe fœtal Allo-immunisation Dépistage des principales aneuploïdies par dosage des séquences spécifiques 13, 18 & 21 Développement de tests pour les maladies mono géniques cffDNA Pat:Mat = 1:1 Pat:Mat = 1:20 Forte fragmentation Petits fragments (≈143 pb) Faible concentration ADN maternel prédominant: ratio 1/10-1/20 Forte homologie avec ADN maternel Difficile d’identifier une mutation portant sur un seul nucléotide

VALIDATION ANALYTIQUE Objectif Mise au point d’une MEMO-PCR fluorescente-Analyse de fragments pour la détection de la mutation paternelle p.Phe508del dans le sang maternel dans le cadre du DPNI de la Mucoviscidose MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE

VALIDATION ANALYTIQUE MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE

Introduction = 1ère indication de DPN 450 en 2013 (chiffres ABM) MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE p.Phe508del 67% Mucoviscidose Prévalence : 1/4300 naissances Fréquence hétérozygotes : 1/33 Gene : CFTR (7q31) = 1ère indication de DPN 450 en 2013 (chiffres ABM)

VALIDATION ANALYTIQUE MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE

Méthode MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE Mutant Enrichment with 3’ Modified Oligonucleotides MEMO _ PCR (Lee et al 2011) Principe Enrichissement en allèle muté par blocage de l’allèle normal par une 3ème amorce X ADN normal ADN mutant X Amorce bloquante Amorce forward Amorce reverse

Méthode Nouvelle combinaison = PCR fluorescente + Principe MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE Mutant Enrichment with 3’ Modified Oligonucleotides MEMO _ PCR (Lee et al 2011) Association à différents outils de biologie moléculaire classique Nouvelle combinaison = PCR fluorescente + Analyse de fragments Principe Enrichissement en allèle muté par blocage de l’allèle normal par une 3ème amorce PCR Classique PCR MEMO WT 100% Muté 50% Muté 10% X ADN normal ADN mutant X Amorce bloquante Amorce forward Amorce reverse

Process Seuil de sensibilité MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE CLINIQUE Seuil de sensibilité Choix des amorces génériques et bloquante TM Marquage FAM Design 1 / Design 2 : Allèle muté = 146/85 pb Allèle normal = 149/88 pb MN 20% Définition des conditions de PCR MN 10% ADN génomiques contrôles : Témoin négatif = F508del-/- Témoin positif = F508del+/- MN 5% Validation du seuil de détection (sensibilité) MN 2% Chimères d’ADN : 2, 5, 10 et 20% d’allèle cible muté [ ]°finale = 100 pg/mL TN

Diagnostic d’exclusion = Process MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE Exemple ADN maternel cffDNA (plasma maternel) ADN paternel Profil tri-allélique Diagnostic d’exclusion = IMPERATIF Contrôler la présence de cffDNA dans l’échantillon analysé Test Minifiler® Guissart et al 2015 Profil tri-allélique présence cffDNA Profil >3 allèles présence ADN exogène

VALIDATION ANALYTIQUE MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE

VALIDATION ANALYTIQUE Etude clinique MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE Etude rétrospective Répartition Dix familles (11 plasmas) répondant aux indications du test : EN AVEUGLE… 24 plasmas de femmes enceintes De 9 à 36 SA Couples à risque de CF : Antécédents familiaux Signes d’appels échographiques ? p.Phe508del p…. MEMO PCR Fluorescente _ analyse de fragments En triplicat CIQs : Blancs/TN/TM/MN2 à 20% Treize plasmas contrôles : 9 Témoins négatifs (Parents CFTR -/-) 4 Témoins positifs (Mère F508del+/-)

En accord avec les résultats MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE 24 plasmas testés 13 plasmas contrôles 9 F508del - 9 VN _0 FP 4 F508del + 4 VP_0 FN 11 plasmas de couple à risque de transmettre l’allèle muté paternel F508del 5 En accord avec les résultats CVS ou LA 6 F508del+ Excellente sensibilité, spécificité Détection de la F508del dès 9 SA

VALIDATION ANALYTIQUE Conclusions MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE CAS 5 : design 1 1/3 Avantages Faible coût Simple et rapide d’exécution Interprétation facile Fiable Reproductible Réplicat 1 Réplicat 2 Réplicat 3 CAS 5 : design 2 3/3 Inconvénient Taille du cffDNA : ≈143 pb Réplicat 1 Réplicat 2 Perspectives Application à d’autres pathologies pour des mutations de type petite insertion/délétion Réplicat 3

Passage en DIAGNOSTIC… selon le logigramme ci contre Conclusions STRATEGIE DIAGNOSTIQUE Recherche de l’allèle muté paternel F508del : TEST 1 : MEMO_PCR fluorescente_A. Fragments TEST 2 : PCR Multiplex fluorescente Passage en DIAGNOSTIC… selon le logigramme ci contre (Médecine Périnatale, Mars 2016 : sous presse)

Remerciements Equipe DPNNI Responsable: Dr. Marie-Claire VINCENT Laboratoire de Génétique Moléculaire CHU Montpellier – France (Pr. M. Claustres ; Pr. M. Koenig) Equipe DPNNI Responsable: Dr. Marie-Claire VINCENT Vanessa DEBANT Charlotte DUBUCS Dr. Claire GUISSART Frédéric TRAN MAU-THEM Collaborations Cliniciens CHU Nice : Dr. C. Rouzier Hôpital St Joseph, Marseille : Dr. MP. Bréchard CHU Montpellier : Dr. J. Puechberty CHU Nîmes : Dr. P. Khau Van Kien CHU Toulouse : Dr. E. Bieth Equipe Mucoviscidose Dr. Caroline RAYNAL Dr. Anne BERGOUGNOUX Equipe Diagnostic préimplantatoire Dr. Anne GIRARDET Merci de votre attention …

VALIDATION ANALYTIQUE Résultats MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE

Résultats TOUS en accord avec ceux du DPN invasif MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE Résultats TOUS en accord avec ceux du DPN invasif

Spectre des mutations en France Introduction MUCOVISCIDOSE VALIDATION ANALYTIQUE VALIDATION CLINIQUE c.579+1G>T (711+1G>T) c.2051_2052delinsG (2183AA>G) c.1680-886A>G (1811+1,6kbA>G) p.Gly542* p.Gly551Asp c.262_263delTT (394delTT) p.Arg334Trp p.Phe508del 67% 81% 60% Spectre des mutations en France Mucoviscidose Prévalence : 1/4300 naissances Fréquence hétérozygotes : 1/33 Gene : CFTR (7q31) = 1ère indication de DPN 450 en 2013 (chiffres ABM)