Dépistage non invasif des principales aneuploïdies (trisomies 21, 18 et 13) par la plateforme de séquençage par semi-conducteurs : résultats d’une étude pilote prospective multicentrique Consortium H+ L. Allach El Khattabi*, P. Gueguen*, S. Brun*, N. Chatron*, J. Nectoux, A. Sorlin, E. Guichoux, J. Pipoli da Fonseca, M. Quere, J. Boudjarane, C. Bonnet, S. Schutz, F. Letourneur, A. Coustier, C. Schluth-Bolard, P. Jonveaux, B. Arveiler, V. Paquis-Fluckinger, S. Bannwarth, C. Bardel, F. Tores, C. Badens, M. Goossens, M. Vidaud, D. Sanlaville*, C. Ferec*, JM. Dupont*, C. Rooryck* *ces auteurs ont contribué de façon équivalente à ce travail

DPNI aneuploïdies – état des lieux Matériel : ADN plasmatique libre circulant

DPNI aneuploïdies – état des lieux Matériel : ADN plasmatique libre circulant Technologies : Séquençage Massif en Parallèle (MPS)

DPNI aneuploïdies – état des lieux Matériel : ADN plasmatique libre circulant Technologies : Séquençage Massif en Parallèle (MPS) Plateforme Illumina +++ Méta-analyse de Gil et al, Ultasound Obst Gyn 2015   N études N aneuploïdes/ euploïdes Taux de détection combiné (IC95%) Taux de faux positifs combiné (IC95%) Trisomie 21 – grossesses singletons 24 1051/21608 99,2 % (98,5 – 99,6) 0,09 % (0,05 – 0,13) Trisomie 18 – grossesses singletons 21 389/21306 96,3 % (94,3 – 97,9) 0,13 % (0,07 – 0,20) Trisomie 13 – grossesses singletons 18 139/18059 91,0 % (85,0 – 95,6) 0,13 % (0,05 – 0,26)

DPNI aneuploïdies – état des lieux Matériel : ADN plasmatique libre circulant Technologies : Séquençage Massif en Parallèle (MPS) Plateforme Illumina +++ Puce à ADN (Ariosa Diagnostics) Juneau et al, Fet Diag Ther 2014

Qu’en est-il des séquenceurs type semi-conducteur (Ion Proton) ? Appareils disponibles dans plusieurs centres de génétique Rapidité de séquençage Analyse simple des données (interface web reliée à un serveur autonome) Débit compatible avec l’activité des petites à moyennes structures

Qu’en est-il des séquenceurs type semi-conducteur (Ion Proton) ? Appareils disponibles dans plusieurs centres de génétique Rapidité de séquençage Analyse simple des données (interface web reliée à un serveur autonome) Débit compatible avec l’activité des petites à moyennes structures MAIS : Très peu de données dans la littérature Liao et al, PNAS 2014

Qu’en est-il des séquenceurs type semi-conducteur (Ion Proton) ? Appareils disponibles dans plusieurs centres de génétique Rapidité de séquençage Analyse simple des données (interface web reliée à un serveur autonome) Débit compatible avec l’activité des petites à moyennes structures MAIS : Très peu de données dans la littérature Consortium national d’utilisateurs de l’Ion Proton (Consortium H+) But : Evaluer les performances de cette plateforme de séquençage dans le dépistage prénatal non invasif des principales aneuploïdies (T21, T18 et T13) Liao et al, PNAS 2014

Matériel et Méthode – Recrutement patientes Etude prospective multicentrique DANNI (Dépistage AntéNatal Non Invasif des maladies génétiques) Coordination : Cochin Indications : Pathologies monogéniques (liées à l’X, achondro, NF1 et mucoviscidose) et Pathologies chromosomiques (Aneuploïdies) Critères d’inclusion : Grossesses à haut risque DPN invasif envisagé > 10 SA Consentement, majorité, affiliation SS

Matériel et Méthode – Recrutement patientes Etude prospective multicentrique DANNI (Dépistage AntéNatal Non Invasif des maladies génétiques) DANNI – aneuploïdies : Consortium H+ : 7 centres français Protocole technique commun But : validation clinique pour transfert technologique Plateforme de Séquençage de Nancy Plateforme de Séquençage de Cochin (APHP – INSERM, label Paris Descartes) Plateforme de Séquençage de Brest Plateforme de Séquençage des hospices civiles de Lyon Plateforme de Séquençage de Nice Plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux Plateforme de Séquençage de Marseille La Timone

Matériel et Méthode – Workflow technique Prélèvement tube BCT Extraction kit Qiagen Quantification fraction fœtale (RASSF1A) Séquençage et analyse bioinformatique

Matériel et Méthode – Séquençage J1 Préparation de la librairie Préparation de la matrice de séquençage Séquençage Analyse des données de séquençage Approche génome entier 1. Réparation des extrémités des fragments 2. Sélection de la taille des fragments 3. Ligation des adaptateurs et PCR

Matériel et Méthode – Séquençage J2 Préparation de la librairie Préparation de la matrice de séquençage Séquençage Analyse des données de séquençage 1. Amplification clonale (fixation aux sphères, PCR en émulsion) 2. Sélection des sphères (enrichissement)

Matériel et Méthode – Séquençage J3 Préparation de la librairie Préparation de la matrice de séquençage Séquençage Analyse des données de séquençage 1. Préparation de la puce + du séquenceur 2. Séquençage

Matériel et Méthode – Séquençage J4 Préparation de la librairie Préparation de la matrice de séquençage Séquençage Analyse des données de séquençage 1. Analyse du signal 2. Analyse chromosomique (par 2 logiciels d’analyse bioinformatique : Wisecondor + logiciel en test) Données brutes (résultats ionogramme) Fichiers de séquences Filtres Alignement

Résultats – description de la population Indications Terme de la grossesse Médiane = 16 SA (11 – 37) Âge maternel Médiane = 34 ans (18 – 49) T21 T18 T13 64 19 13

Résultats techniques et biologiques Nombre de reads : Médiane 15,4 M (2,6 – 82) Fraction fœtale : Médiane 7,3 %(1,7 – 30) Performances techniques Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 Sensibilité (IC95%) 100 % (94,2 – 100 %) 100 % (82,4 – 100 %) 100 % (77,2 – 100 %) Spécificité (IC95%) 100 % (99,2 – 100 %)

Résultats techniques et biologiques Nombre de reads : Médiane 15,4 M (2,6 – 82) Fraction fœtale : Médiane 7,3 %(1,7 – 30) Performances techniques Limites biologiques : Discordances fœto-placentaires non détectables (2 T21 et 1 T18) (Se = 97et 95 %) Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 Sensibilité (IC95%) 100 % (94,2 – 100 %) 100 % (82,4 – 100 %) 100 % (77,2 – 100 %) Spécificité (IC95%) 100 % (99,2 – 100 %)

Résultats techniques et biologiques Nombre de reads : Médiane 15,4 M (2,6 – 82) Fraction fœtale : Médiane 7,3 %(1,7 – 30) Performances techniques Limites biologiques : Discordances fœto-placentaires non détectables (2 T21 et 1 T18) (Se = 97et 95 %) Taux de non rendus = 0,005 % Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 Sensibilité (IC95%) 100 % (94,2 – 100 %) 100 % (82,4 – 100 %) 100 % (77,2 – 100 %) Spécificité (IC95%) 100 % (99,2 – 100 %)

Résultats techniques et biologiques Nombre de reads : Médiane 15,4 M (2,6 – 82) Fraction fœtale : Médiane 7,3 %(1,7 – 30) Performances techniques Limites biologiques : Discordances fœto-placentaires non détectables (2 T21 et 1 T18) (Se = 97et 95 %) Taux de non rendus = 0,005 % Autres anomalies mises en évidence Tri10, Tri9, add(22q), del(4)(q32) Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 Sensibilité (IC95%) 100 % (94,2 – 100 %) 100 % (82,4 – 100 %) 100 % (77,2 – 100 %) Spécificité (IC95%) 100 % (99,2 – 100 %)

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina Taux de non rendus très bas

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina Taux de non rendus très bas Enrichissement de la littérature sur le DPNI aneuploïdies par Ion Proton N Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 n Se Sp Liao et al, 2014 515 55 99,94 % 99,46 % 16 100 % 99,24 % 3 Jeon et al, 2014 155 11 100 % (74,1-100) 100 % (97,3-100) 5 100 % (56,6-100) - Papageorghiou et al, 2015 442 43 (88-100) 99,8% (98,6-100) 10 100 % (58,7-100) 100% (98,7-100) 100 % (35,9-100) Poon et al, 2016 242 35 100 % (90,11-100) 100 % (98,12-100) 4 (51-100) (98-100) 2 (34-100) Présente étude 568 64 100 % (94,2-100) 100 % (99,2-100) 19 100 % (82,4-100) 13 100 % (77,2-100)

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina Taux de non rendus très bas Enrichissement de la littérature sur le DPNI aneuploïdies par Ion Proton Validation clinique multicentrique par des laboratoires académiques => robustesse du protocole technique

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina Taux de non rendus très bas Enrichissement de la littérature sur le DPNI aneuploïdies par Ion Proton Validation clinique multicentrique par des laboratoires académiques => robustesse du protocole technique Validation de l’outil bioinformatique

Discussion L’approche technologique Ion Proton : Performances comparables à celles rapportées avec Illumina Taux de non rendus très bas Enrichissement de la littérature sur le DPNI aneuploïdies par Ion Proton Validation clinique multicentrique par des laboratoires académiques => robustesse du protocole technique Validation de l’outil bioinformatique Passage en diagnostic

Remerciements Aux patientes Aux gynécologues obstétriciens et sages-femmes Hospices civiles de Lyon, Cochin, Louis Mourier, CHU Brest, CHU Bordeaux, CHU Nice, CHU Nancy, CHU La Timone Marseille Aux actifs du consortium P. Gueguen, S. Brun, N. Chatron, J. Nectoux, A. Sorlin, E. Guichoux, J. Pipoli da Fonseca, M. Quere, J. Boudjarane, C. Bonnet, S. Schutz, F. Letourneur, A. Coustier, C. Schluth-Bolard, P. Jonveaux, B. Arveiler, V. Paquis-Fluckinger, S. Bannwarth, C. Bardel, F. Tores, C. Badens, M. Goossens, M. Vidaud, D. Sanlaville, C. Ferec, JM. Dupont, C. Rooryck A JF Vanbellighen Aux soutiens techniques et moraux D Letessier, N Le Du, E Pasmant, B Parfait, A Luscan, A Lebbar, C Leroy, A Briand, Philippe, Gilles, E Pipiras…….

Comparaison des termes de grossesse

Digestion enzymatique DMR hyperméthylation ADN Fœtal circulant RASSF1A ADN Maternel circulant RASSF1A hypométhylation Digestion enzymatique ADNfc intact ddPCR RASSF1A et réf ratio RASSF1A/ réf ADNmc digéré