Intérêt des approches complémentaires (minigènes, ARN du patient, prédictions bioinformatiques) pour l’identification des mutations d’épissage : bilan sur 659 variations des gènes MLH1/MSH2 et BRCA1/BRCA2 Pascaline Gaildrat Inserm U1079, Université de Rouen Centre Normand de Génomique Médicale et Médecine Personnalisée

La génétique médicale post-NGS : le défi de l’interprétation des variations génétiques Variabilité du génome humain (Exome) Prélèvement sanguin Séquençage Nouvelle Génération (NGS) ADN 20.000 Variations dont 1000 rares (<0.1%) 60.706 Exomes (ExAC) : 54% singletons Patient Variation Interprétation biologique et clinique Mutation pathogène

La problématique des variations de signification inconnue Formes héréditaires de Cancer colorectal Gènes BRCA (BRCA1, BRCA2) Formes héréditaires de Cancer du sein et de l’ovaire Gènes MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) Variation de signification inconnue (VSI) Conseil génétique Identification des individus porteurs / non-porteurs parmi les apparentés Thérapies ciblées e.g.: anti-PARP pour patients déficients BRCA Optimisation de la prise en charge MMR : Colonoscopie, Hystéroscopie BRCA : IRM mammaire, Mastectomie, Annexectomie

La problématique des variations de signification inconnue Formes héréditaires de Cancer colorectal Gènes BRCA (BRCA1, BRCA2) Formes héréditaires de Cancer du sein et de l’ovaire Gènes MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) Variation de signification inconnue (VSI) Variations MLH1 MSH2 BRCA1 BRCA2 VSI 45% (257) (288) 51% (1003) 62% (1714) 09/12/15 Effet sur l’épissage ?

L’épissage : étape clé de la maturation des ARNm Région riche en pyrimidines Pré-ARNm + Intron Intron Exon Exon Exon ISE ISS Point de branchement Site 3’ d’épissage Site 5’ d’épissage EPISSAGE ARNm

L’épissage : étape clé de la maturation des ARNm Région riche en pyrimidines Pré-ARNm + - Intron Intron Exon Exon Exon ISE ISS ESE ESS Point de branchement Site 3’ d’épissage Site 5’ d’épissage EPISSAGE PHYSIOLOGIQUE ARNm ESE, Exonic Splicing Enhancer ISE, Intronic Splicing Enhancer ESS, Exonic Splicing Silencer ISS, Intronic Splicing Silencer

Impact potentiel des variations sur l’épissage Région riche en pyrimidines Pré-ARNm + - Intron Intron Exon Exon Exon ISE ISS ESE ESS Point de branchement Site 3’ d’épissage Site 5’ d’épissage ANOMALIE D’EPISSAGE ARNm aberrant ESE, Exonic Splicing Enhancer ISE, Intronic Splicing Enhancer ESS, Exonic Splicing Silencer ISS, Intronic Splicing Silencer

Mise en évidence des mutations d’épissage Test fonctionnel indicateur de défaut d’épissage (minigène) Avantages : Disponibilité du matériel biologique Interprétation facilitée Lien de causalité direct Concordance avec données patient Articles Inserm U1079 : Tournier et al., Hum Mutat, 2008 Bonnet et al., J Med Genet, 2008 Vezain et al., Hum Mutat, 2010 Gaildrat et al., J Med Genet, 2010 Gaildrat et al., Methods Mol Biol, 2010 Thery et al., Eur J Hum Mutat, 2011 Vezain et al, Hum Mutat, 2011 Gaildrat et al., J Med Genet, 2012 Di Giacomo et al., Hum Mutat, 2013 Soukarieh et al., Plos Genet, 2016 Articles en collaboration : Lagarde et al., J Med Genet, 2010 Houdayer et al., Hum Mutat, 2012 Grandval et al., Database, 2013 Thompson et al., Nature Genet, 2014 Thompson et al., Clin Genet, 2014 Grandval et al., J Med Genet, 2015 Puppo et al., Hum Mutat, 2015

Mise en évidence des mutations d’épissage Test fonctionnel indicateur de défaut d’épissage (minigène) Avantages : Disponibilité du matériel biologique Interprétation facilitée Lien de causalité direct Concordance avec données patient Prédictions bioinformatiques Analyse des profils d’épissage à partir de l’ARN du patient (LLB, Paxgene)

Impact sur l’épissage des variations de signification inconnue : gènes MMR (syndrome de Lynch) Réseau français d’Oncogénétique 341 Variations des gènes MLH1 et MSH2 CHU, Rouen : S. Baert-Desurmont 54 (16%) effet partiel 111 (33%) avec effet sur l’épissage 57 (17%) effet majeur 230 VSI (67%) sans effet Contribution à la classification des variations Base de données MMR Tournier et al., Hum Mutat, 2008; Soukarieh et al., Plos Genet, 2016; Données non publiées

Impact sur l’épissage des variants de signification inconnue : gènes BRCA (cancer héréditaire du sein et de l’ovaire) Réseau français d’Oncogénétique 318 Variations des gènes BRCA1 et BRCA2 CFB, Caen : S. Krieger 54 (17%) effet partiel 102 (32%) avec effet sur l’épissage 48 (15%) effet majeur 216 VSI (68%) sans effet Contribution à la classification des variations Base de données BRCA Bonnet et al., J Med Genet, 2008; Gaildrat et al., J Med Genet, 2010; Thery et al., Eur J Hum Mutat, 2011, Gaildrat et al., J Med Genet, 2012; Di Giacomo et al., Hum Mutat, 2013; Données non publiées

Effet et localisation des 137 mutations «sites d’épissage» Prédictions bioinformatiques Données minigènes 84 variants (39%) Altération 5’/3’ ss Saut d’exon V Wt Mt Exon +Exon15 Exemple : MSH2 c.2634G>A (p.=) ΔExon15 53 variants (25%) Nouveau 5’/3’ ss Modification d’exon V Wt Mt Exon +Exon5 Exemple : BRCA2 c.467A>G (p.Asp156Gly) Exon5del9 Effet partiel Effet majeur Nb variations Intron Exon Intron

Effet et localisation des 76 mutations «ESR» Prédictions bioinformatiques Données minigènes 76 variants (36%) Altération ESR Saut d’exon V Wt Mt Exon +Exon7 Exemple : BRCA2 c.617C>G (p.Ser206Cys) ΔExon7 Effet partiel Effet majeur

Effet et localisation des 76 mutations «ESR» Prédictions bioinformatiques Données minigènes 76 variants (36%) Altération ESR Saut d’exon V Wt Mt Exon +Exon7 Exemple : BRCA2 c.617C>G (p.Ser206Cys) ΔExon7 Effet partiel Effet majeur Etude ciblée : exons “modèles” Bonne nouvelle : très souvent sous-estimées, les mutations de régulation d’épissage peuvent maintenant être prédites par des approches bioinformatique Soukarieh et al., Plos Genet, 2016 Poster #3559 Gaildrat et al., J Med Genet, 2012 Di Giacomo et al., Hum Mutat, 2013 Données non publiées

Mutations ESR dans 2 exons «modèles» de BRCA2 Exon 7 : 34% mutations ESR (11 /32 variations) Di Giacomo et al., Hum Mutat, 2013 Exon 18 : 36% mutations ESR (13/36 variations) Données non publiées c.8010G>A WT c.7985C>T c.7988A>T c.7992T>A c.7992T>C c.8007A>G c.8009C>G c.8009C>T c.7978T>G c.8019A>G c.8027T>A c.8072C>T c.8084C>T c.8090G>A c.8091C>T c.8111C>T c.8113A>G Δe18 +e17+18 Δe17-18 c.8243G>A c.8149G>T c.8153T>C c.8165C>G c.8169T>A c.8187G>T c.8215G>A c.8238A>C c.8240T>G c.8117A>G c.8258_8260del c.8258T>G c.8281T>C c.8284C>T c.8303T>A c.8317T>C c.8323A>C c.8324T>G c.8009C>A

Prédictions bioinformatiques des mutations ESR Score ESRseq (Exonic Splicing Regulator sequence) des 4096 hexamères Ke et al., Genome Res, 2011 Inclusion de l’exon => Score ESRseq > 0 => ESE Exclusion de l’exon => Score ESRseq < 0 => ESS Neutre => Score ESRseq = 0 => N Variation Impact d’une variation sur les ESR C G A A G G T T G T T ESE ESS ΔtESRseq (Variant versus WT) 6 hexamères chevauchants < 0 : prédictif Saut d’exon

Prédictions des mutations ESR dans 2 exons «modèles» de BRCA2 ΔtESRseq 11 Variations => ESR 21 variations sans effet Di Giacomo et al., Hum Mutat, 2013 Exon 18 13 Variations => ESR 23 variations sans effet ΔtESRseq Données non publiées

=> Optimisation de la génomique médicale Conclusions Tests minigène : 659 variations MLH1/MSH2 et BRCA1/BRCA2 Nombre important des mutations d’épissage (30%) Concordance entre données «minigène» et résultats «ARN patient» Contribution à la classification des VSI Fiabilité des prédictions des mutations 5’/3’ ss Intérêt du score ΔtESRseq pour la prédiction des mutations ESR Perspectives Amélioration des prédictions bioinformatiques ESR (nouveaux jeux de données, nouvelles méthodes) Evaluation du caractère pathogène des mutations d’épissage à effet partiel (analyse dans le tissu relevant, analyse de coségrégation) => Optimisation de la génomique médicale

Centre Normand de Génomique Médicale et Médecine Personnalisée Remerciements Remerciements Service de Génétique Clinique, CHU de Rouen S. Baert-Desurmont T. Frebourg Inserm U1079, Rouen G. Castelain, O. Soukarieh D. Di Giacomo, J. Abdat, A. Killian, J.C. Thery, I. Tournier, C. Bonnet H. Tubeuf, S. Aklil A. Drouet, M. Vezain M. Tosi A. Martins Laboratoire de Biologie Clinique et Oncologique, Centre François Baclesse, Caen G. Davy S. Krieger Centre Normand de Génomique Médicale et Médecine Personnalisée Réseaux français d’Oncogénétique Service de Génétique, Institut Curie, Paris S. Caputo, E. Rouleau C. Houdayer Société Interactive biosoftware A. Blavier Financements pascaline.gaildrat@univ-rouen.fr