Laboratoire de Génétique constitutionnelle - Inserm U830 Les paralogues de RAD51 dans la prédisposition génétique aux cancers du sein et de l’ovaire Lisa Golmard Laboratoire de Génétique constitutionnelle - Inserm U830 Institut Curie, Paris

Les paralogues de RAD51 : RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2, XRCC3 Figure 3 | Interplay of the RAD51 paralogues during homologous recombination repair of double-strand breaks. RAD51 paralogue proteins that are involved in homologous recombination repair (HRR) are associated with the strand-exchange step in mammalian cells. RAD51 paralogues form at least two different complexes: the first involves RAD51B, RAD51C, RAD51D and XRCC2 (BCDX2); and the second involves RAD51C and XRCC3. These complexes interact with RAD51 to promote strand invasion and/or pairing during homologous recombination129. RPA, replication protein A. Les paralogues de RAD51 forment deux complexes : BCDX2 et CX3 Interaction avec RAD51  Recombinaison homologue Skorski, Nat Rev Cancer, 2002

RAD51C/FANCO et RAD51D Gène candidat Mutations inactivatrices : 6/480 familles sein/ovaire (1,3%) 0/620 familles sein 0/2 912 témoins Gène candidat Mutations inactivatrices : 8/911 familles sein/ovaire (0,9%) 0/737 familles sein 1/1 060 témoins Meindl et al., Nat Genet, 2010 Loveday et al., Nat Genet, 2011

XRCC2 et RAD51B Exome 2 cas de cancer du sein familial Gène candidat 1 cas de cancer du sein précoce (34 ans) ATCD familial de cancer de l’ovaire Park et al., Am J Hum Genet, 2012 Golmard et al., BMC Cancer, 2013

Contribution des paralogues de RAD51 dans la prédisposition génétique aux cancers du sein/ovaire 2 649 cas consécutifs de cancers sein/ovaire Critères d’indication d’analyse BRCA1/2 Critères individuels : âge de survenue précoce, type histologique, … Critères familiaux : plusieurs cas Consultations : Institut Curie, Paris – Centre François Baclesse, Caen – CHU de Rouen – CHU de Rennes Analyse génétique : Institut Curie, Paris – Centre François Baclesse, Caen

Analyse génétique des paralogues de RAD51 Enrichissement SureSelectXT et séquençage sur GAIIx Enrichissement AmpliSeq et séquençage sur PGM en pools Centre F. Baclesse – 1 701 patients Institut Curie – 948 patients

Critères de sélection des variants Exclusion des polymorphismes variants ≥ 1% dans 1000 Genomes Project ou Exome Sequencing Project Variants tronquants retenus tous Variants d’épissage retenus Site donneur ou accepteur d’épissage : +1 +2 -1 -2 ou MaxEntScan - 15% et SpliceSiteFinder-like - 5% et étude ARNm Variants faux-sens retenus Align-GVGD ≥ classe C45

Résultats : mutations dans les paralogues de RAD51 et cancers sein/ovaire Au moins un ovaire Gène Sein seul n=2 063 n (%) Sein et ovaire n=538 Ovaire seul n=32 Total Ovaire n=570 Total n=2 649 RAD51B 8 (0,39) 0 (0,00) 1 (3,13) 1 (0,18) 9 (0,34) RAD51C 3 (0,15) 8 (1,49) 9 (1,58) 12 (0,45) RAD51D 4 (0,19) 2 (0,37) 3 (0,53) 7 (0,26) XRCC2 2 (0,10) 2 (0,08) XRCC3 2 (6,25) 2 (0,35) 5 (0,19) 20 (0,97) 10 (1,86) 5 (15,6) 15 (2,63) 35 (1,32)

Conclusions 1ère identification de mutations XRCC3 dans les cancers sein/ovaire 1ère étude des cinq paralogues de RAD51 sur une grande cohorte Mutations chez cas de cancer du sein seulement A considérer malgré l’absence d’ATCD de cancer de l’ovaire

Remerciements Laboratoire de Génétique constitutionnelle Claude Houdayer Dominique Stoppa-Lyonnet Virginie Moncoutier Khadija Abidallah Henrique Tenreiro Anthony Laugé Inserm U830 Olivier Delattre Marc-Henri Stern Inserm U900 - Bioinformatique Emmanuel Barillot Centre François Baclesse, Caen Laboratoire de Biologie et Génétique du cancer Dominique Vaur Laurent Castéra Sophie Krieger Génétique clinique Paris/St Cloud Dominique Stoppa-Lyonnet Catherine Noguès Antoine de Pauw Et tout le service de Génétique de l’Institut Curie Génétique clinique Pascaline Berthet, Caen Thierry Frébourg, Rouen Caroline Abadie, Rennes Catherine Dugast, Rennes Plateforme NGS - ICGex Sylvain Baulande Projet INCa Recherche translationnelle

Perspectives Evaluer la pénétrance des mutations dans les paralogues de RAD51 : - études de coségrégation chez les apparentés - méta-analyse en cours pour RAD51C et RAD51D  Risque de cancer sein/ovaire  Recommandations de prise en charge Inhibiteurs de PARP : AMM en cas de mutation BRCA1/2 Evaluer leur efficacité en cas de mutation des paralogues de RAD51 Tests fonctionnels  Préciser le taux de mutations : 1,3 à 2,0%

Stimulation de la formation du nucléofilament par les paralogues de RAD51 Saccharomyces cerevisiae Paralogues de RAD51 Fixation de RAD51 sur l’ADN simple-brin Stimulent la recombinaison homologue Gaines et al., Nat Comm, 2015

Remodelage du filament nucléoprotéique par les paralogues de RAD51 Caenorhabiditis elegans Paralogues de RAD51 Flexibilité du nucléofilament Stimulent l’échange de brins et la recombinaison homologue Taylor et al., Cell, 2015

Protection des fourches de réplication par les paralogues de RAD51 CHO (Hamster) Somyajit et al., Nucleic Acids Res, 2015

Les paralogues de RAD51 : 20 à 30% d’homologie de séquence en acides aminés Walker A et B : liaison et hydrolyse de l’ATP HhH ou C-terminal : liaison à l’ADN Lin et al., PNAS, 2006

Tests fonctionnels : un déficit en paralogue de RAD51 entraîne un défaut de recombinaison homologue Induction de cassures double brin de l’ADN  Défaut de recombinaison homologue  instabilité génomique Observation des foci RAD51 Mesure de la survie cellulaire Sensibilité aux inhibiteurs de PARP Mesure de la recombinaison homologue avec un plasmide type pDR-GFP Min et al., Mol Cancer Ther, 2013 Parvin et al., J Vis Exp, 2011 Chun et al., Mol Cell Biol, 2013 Takata et al., Mol Cell Biol, 2000

XRCC2 et cancer du sein Etude cas-témoins : variants non-tronquants : 20/3 548 cas de cancer du sein familial (0,6%) 9/1 435 témoins (0,6%) - Pas d’association entre les variants XRCC2 et le risque de cancer du sein - RR < 2 ne peut pas être exclu - Variants XRCC2 n’expliquent pas une grande proportion du cancer du sein familial Hilbers et al., J Med Genet, 2012

Prédisposition génétique aux cancers sein/ovaire 5 à 10% des cancers du sein 5 à 15% des cancers de l’ovaire RAD51C : Meindl et al., 2010 RAD51D : Loveday et al., 2011

RAD51B et cancer du sein Gène candidat dans une étude cas-témoins en 2011 : 188 cas de cancer du sein familial BRCA1/2-négatifs / 190 témoins  Aucune mutation SNPs RAD51B associés au cancer du sein

Résultats : âges au diagnostic de cancers sein/ovaire Gène RAD51B RAD51C RAD51D XRCC2 XRCC3 Total Sein n 7 4 5 1 3 20 Min-Max 27-66 32-55 38-68 52-52 29-56 27-68 Médiane 50 39 42 52 31 43 Moyenne 47 41 46 45 Ovaire 8 2 14 42-42 48-66 36-66 53-58 58 62 56 57 55

Pools de 20 ADN 400 patients : 20 lignes x 20 colonnes, dans 6 plaques 96 puits 20 pools « lignes » 20 pools « colonnes » Après analyse des 20 pools lignes et 20 pools colonnes par le PGM (4 runs) : séquençage Sanger de l’ADN à l’intersection des 2 pools

Critères d’indication de diagnostic génétique de prédisposition aux cancers du sein et de l’ovaire Histoire personnelle adénocarcinome mammaire avant 36 ans adénocarcinome triple négatif (RO- RP- HER2-) avant 51 ans adénocarcinome type médullaire quel que soit l’âge au diagnostic adénocarcinome de l’ovaire avant 70 ans adénocarcinome mammaire + cancer ovaire cancer du sein masculin et/ou Histoire familiale 3 cas de cancer du sein / 1er ou 2e degré passant par un homme 2 cas de cancer du sein / 1er ou 2e degré passant par un homme avec critères d’âge 1 cas de cancer du sein et 1 ovaire / 1er ou 2e degré passant par un homme

Résultats : signature BRCAness Signature génomique LST : Large-scale State Transition LST LOH Tumeur RAD51B c.22C>T, p.Arg8* Low Non Sein c.139C>T, p.Arg47* c.1036+5G>A High Oui RAD51C c.1026+5_1026+7delGTA RAD51D c.754C>T, p.Arg252* Ovaire

Résultats : signature BRCAness et IHC RAD51B Signature génomique LST : Large-scale State Transition LST LOH IHC Tumeur RAD51B c.22C>T, p.Arg8* Low Non Sein c.139C>T, p.Arg47* + c.1036+5G>A High Oui ++ RAD51C c.1026+5_1026+7delGTA RAD51D c.754C>T, p.Arg252* Ovaire

Signature génomique tumorale de BRCAness : défaut de recombinaison homologue Signature génomique LST : Large-scale State Transition : Nombre de réarrangements génomiques > 10Mb Cut-off : 15 ou 20 pour cellules diploïdes ou tétraploïdes LST-high : défaut de recombinaison homologue Mutations BRCA1/2 Méthylation RAD51C Popova et al., Cancer Res, 2012 Manié et al., Int J Cancer, 2015

Discussion : limites de l’étude Réarrangements de grande taille non détectés par l’analyse en pools mais non vus sur 1 701 cas analysés en SureSelectXT Seules les régions codantes et jonctions exons-introns sont analysées Présence possible de mutations délétères dans des régions régulatrices Variants de signification inconnue, principalement faux-sens  Nécessité de développer des tests fonctionnels : en cours