Assises de génétique humaine et médicales, Lyon, 3-5/02/2016 Séquençage ciblé à haut débit pour le diagnostic de routine des mutations somatiques théranostiques sur échantillons tumoraux fixés au formol et inclus en paraffine: Une étude prospective de 3366 échantillons tumoraux. [#3182] A Lespagnol, A Aliouat, F Denoual, A Mosser, F Guenot, G Moron, H Gourdet, C Chaplais,M de Tayrac & Jean Mosser Service de génétique moléculaire et génomique, CHU de Rennes Oncogénomique translationnelle, IGDR, UMR6290, CNRS, Université de Rennes1 Plateforme Génomique environnementale et humaine, Université de rennes1, Biogenouest Génomique

Caractérisation des génomes tumoraux Identifier des cibles potentielles et/ou mutations de sensibilité – Ex : Mutations (EGFRs, BRAFV600, MET, BRCA, KIT...), Amplification (HER2…), Translocations (ALK, ROS1…) Identifier des mutations de résistance I ou II – Ex : Mutations EGFRr (TKI 1 e, 2 e et 3 e G), ALKr (TKI 1 e, 2 e et 3 e G), KRAS…… Contribuer au diagnostic – Ex : altérations IDH, 1p19q [gliomes diffus] Définir un risque pronostique particulier – Ex : Mutation BRAF [CCR], TERTp [gliome] Suivre le patient – Ex : Marqueur moléculaire de la maladie dans les effluents biologiques Stratégie thérapeutique - Caractérisation moléculaire de la tumeur Objectif : la médecine personnalisée

Réalisation des tests : 28 PF GMC INCa Subvention de l’INCa pour la recherche de ces mutations (AMM, ATU, anticipation) 2008 : K-RAS / CCR métastatique – anticorps contre EGFR 2009 : EGFR / CBNPC – EGFR-TKI (gefitinib en 1 e ligne) 2011 : biomarqueurs émergents 2012 : translocations ALK / CBNPC - Crizotinib 2012 : BRAF V600 / mélanome – Vemurafenib 2013 : programme AcSe : Basket : tumeur en échappement thérapeutique 2013 : KRAS AMM étendue (NRAS) / CCR métastatique – anticorps contre EGFR Augmentation du nombre de tests : Ex. CBPNPC : diagnostic 8 cibles, suivi : 35 cibles Evolution du concept : Organe -> stratification moléculaire plus exhaustive (Umbrella) Personnaliser la médecine en fonction de la stratification moléculaire tumorale Au diagnostic : guider le traitement Au suivi : adapter le traitement en fonction de la dynamique clonale de la tumeur Technique de biologie moléculaire classique limitée en rendement et sensibilité  2013 : AAP-INCa Transfert du NGS en diagnostic des cancers

Développer le séquençage haut-débit pour le diagnostic et le suivi des tumeurs solides en respectant ces contraintes Haut-débitNombre patients (60-80/semaine) Nombre marqueurs (20 gènes) Rapide Délais de rendu de résultat (7 – 10 jours) FlexibleEvolution des thérapies ciblées – gestion des résistances Econome€ (INCa) ADN Echantillons précieux (exérèse, biopsie, ponction…) Sensible5% des prélèvements avec % cellules tumorales < 10% ADNtc : proportion faible de l’ADN libre circulant FFPEQualité et quantité d’ADN médiocre (20% [dsDNA] < 1ng/µl) AltérationsMutations, Délétions, Insertions, Translocation, CNV AccréditationISO Contraintes du transfert du NGS

Panel NGS tumeurs solides V5 : 127 amplicons : 6 kb GeneExons BRAF* Ex11 Ex15 EGFR* Ex18 Ex19 Ex20 Ex21 IDH1**Ex4 KRAS* Ex2 Ex3 Ex4 NRAS* Ex2 Ex3 Ex4 KIT* Ex11 Ex13 Ex17 Ex18 PDGFRA* Ex12 Ex14 Ex18 GeneExons AKT1Ex3 CTNNB1**Ex3 ERBB2Ex20 ERBB4 Ex10 Ex12 FGFR2 Ex7 Ex9 Ex12 Ex14 FGFR3 Ex7 Ex9 Ex14 Ex16 HRAS Ex2 Ex3 Ex4 IDH2**Ex4 KIT* Ex8 Ex9 Ex14 MAP2K1Ex2 PIK3CA** Ex10 Ex21 PTENEx7 Panel de 20 gènes sur tous les patients: Régions d’intérêts GeneExons ALK Ex22 Ex23 Ex24 Ex25 Ex26 MET Ex2 Ex14 Ex16 Ex17 Ex18 Ex19 Ex20  Thérapies ciblées, diagnostic (AMM, ATU, biomarqueur)  Programme AcSe  BdD, Essaies cliniques… Actes référencés RIHN **Liste principale *Liste complémentaire **NGS < 20kb

Préparation des librairiesPipeline d’analyses => Estimation de la performance de l’ensemble du workflow Workflow : 3 étapes Production de la librairie (amplicon) Séquençage (MiSeq) Variant DX : pipeline automatisé

DNA Pre-amp Ampli Tagging-a1 Tagging-a2 Sequencing 3 steps_PCR CS1-Tagged TS CS2-Tagged TS P5_CS1 P7_BC_CS2 P5CS1CS2P7BC Amplification (2304 wells) Tagging Pre-Amplification PROTOCOLE : Schéma Analytique SCHEMA GENERAL # Tam Seq Production des librairies Production des librairies Duplication – 3 étapes

Analytique Access Array (Fluidigm) Targets Amplification 48 librairies / 4 hrs Access Array (Fluidigm) Targets Amplification 48 librairies / 4 hrs LabChip-Gx (Perkin Elmer) Library quantification 96 librairies / 2 hrs LabChip-Gx (Perkin Elmer) Library quantification 96 librairies / 2 hrs Zephyr (Perkin Elmer) Library pooling 96 librairies / 1 hr Zephyr (Perkin Elmer) Library pooling 96 librairies / 1 hr MiSeq (Illumina) Ultra-deep sequencing 300 cycles / 24 hrs MiSeq (Illumina) Ultra-deep sequencing 300 cycles / 24 hrs Séquençage 2 x 150pb

Technologie et Plan d ’ Expérience QC_librairies QC_Amplicons Hot-spots indels Hot-spots indels Hot-spots snp Hot-spots snp Valid_technics Nbre reads Qualité des reads (%Q30) % mapping Reads Nbre reads Qualité des reads (%Q30) % mapping Reads a1_R1 / a1_R2 / a2_R1 / a2_R2 Nbre reads / amplicons / library a1_R1 / a1_R2 / a2_R1 / a2_R2 Nbre reads / amplicons / library Détection et Annotation des insertions & délétions Détection et Annotation des mutations Pour chaque position « HOTSPOT » Nbre reads pour A / T / G & C Qualité phred pour A / T / G & C Pour chaque position « HOTSPOT » Nbre reads pour A / T / G & C Qualité phred pour A / T / G & C QC_RUN Density (K/mm2) Cluster/Reads PF (%) Reads Q > Q30 (%) Density (K/mm2) Cluster/Reads PF (%) Reads Q > Q30 (%) bcl Go No Go Go No Go Go No Go Check Analy se Séquença ge ANALYSE DES DONNES VALIDATION [AF variable]

Sensibilité 77,4% Spécificité 98,4% Seuil de détection 2% Sensibilité 99,9% Spécificité 99,9% CTRL : 584 FFPE: ans de développement Optimisation du protocole de production des librairies Optimisation du pipeline d’analyses Analyse en duplicats 2014 : le NGS est en routine sur échantillons tumoraux NGS comparé aux techniques classiques de diagnostic (pyroséquencage + ARMS)

Sensibilité 77,4% Spécificité 98,4% Seuil de détection 2% Sensibilité 99,9% Spécificité 99,9% CTRL : 584 FFPE: ans de développement Optimisation du protocole de production des librairies Optimisation du pipeline d’analyses Analyse en duplicats 2014 : le NGS est en routine sur échantillons tumoraux NGS comparé aux techniques classiques de diagnostic (pyroséquencage + ARMS) 3 Faux positifs – 3 faux négatifs

Sensibilité 77,4% Spécificité 98,4% Seuil de détection 2% Sensibilité 99,9% Spécificité 99,9% CTRL : 584 FFPE: ans de développement Optimisation du protocole de production des librairies Optimisation du pipeline d’analyses Analyse en duplicats 2014 : le NGS est en routine sur échantillons tumoraux NGS comparé aux techniques classiques de diagnostic (pyroséquencage + ARMS) Novembre 2014 : NGS en routine pour tous les marqueurs -> n > 6000 patients testés sur plus de 100 amplicons Automatisation de la validation biologique / interface graphique

Sensibilité 77,4% Spécificité 98,4% Seuil de détection 2% Sensibilité 99,9% Spécificité 99,9% CTRL : 584 FFPE: ans de développement Optimisation du protocole de production des librairies Optimisation du pipeline d’analyses Analyse en duplicats 2015 : LE NGS est réalisé sur l’ADN tumoral circulant NGS comparé aux techniques classiques de diagnostic (pyroséquencage + ARMS) Novembre 2014 : NGS en routine pour tous les marqueurs -> n > 6000 patients testés sur plus de 100 amplicons Automatisation de la validation biologique / interface graphique NGS comparé échantillons FFPE vs plasma (n= 47) Sensibilité 93% Spécificité 100% Concordance 90%

Sensibilité 77,4% Spécificité 98,4% Seuil de détection 2% Sensibilité 99,9% Spécificité 99,9% CTRL : 584 FFPE: ans de développement Optimisation du protocole de production des librairies Optimisation du pipeline d’analyses Analyse en duplicats 2015 : LE NGS est réalisé sur l’ADN tumoral circulant NGS comparé aux techniques classiques de diagnostic (pyroséquencage + ARMS) Novembre 2014 : NGS en routine pour tous les marqueurs -> n > 6000 patients testés sur plus de 100 amplicons NGS comparé échantillons FFPE vs plasma (n= 47) Sensibilité 93% Spécificité 100% Concordance 90% Janvier 2015 : NGS en routine sur ADN tc -> EGFRs & r / AMM modifié EGFR-TKI The pooled sensitivity = [95% CI, 0.513–0.716) specificity = (95% CI, 0.929–0.977)

Panel classique (AMM & BE) : 33% patients mutésPanel NGS : 50% Patients mutés Amélioration significative de la stratification moléculaire du CPNPC 50% des patients avec mutation -> intérêt pour le suivi [ADNct] Exemple : CBNPC (500 patients) FFPE : Stratification moléculaire améliorée au diagnostic

RCP moléculaire mensuelle : mutations non référencées Mise en place organisationnelle depuis juillet 2014 Effective 1er janvier 2015 Périmètre : Bretagne (Pole Régional de Cancérologie) Coordination : Rennes Médecins référents : digestif, pneumo, dermato, neuro, oncopédiatrie, gyneco, oncogénétique… Biologistes : généticiens, cytogénéticiens, pathologistes Patients porteurs de mutations hors AMM et ATU est discutés Essais cliniques Inclusion dans AcSe via NGS Essais précoces : AO CLIP 2 (Centres labellisés INCa de phase précoce) CR classique : CR AMM conditionnée (EGFRs) Stratification moléculaire : Prise en charge des patients

Au Diagnostic : Panel NGS – Bilan patients CBNPC 9 EGFR s 5 EGFR + T790M 5 KRAS+ 2 BRAF+« Négatif » pour EGFR (?) 1 PI3KCA+ 23% EGFRs 8% T790M 8% KRAS -> sélection des patients -> démarche de suivi se met en place ADN circulant tumoral : Diagnostic

11/07/14 03/12/14 12/03/15 Tarceva 04/0819/09 03/1218/03 ADN circulant tumoral : Suivi Panel NGS – Ex1 CBNPC EGFR-TKI

03/10/1414/11/1426/12/1403/02/1510/04/15 09/09 07/1018/11 09/12 24/03 Cisplatine Alimta ADN circulant tumoral : Suivi Panel NGS – Ex2 CBNPC ChimioT

Conclusion : Place du NGS dans le diagnostic et le suivi moléculaire des patients Progression Stabilisation Réponse Récidive Seuil du diagnostic Seuil de détection de récidive Marqueur Charge tumorale DIAGNOSTIC Stratégie thérapeutique Pronostic Identifier surrogate SUIVI Surrogate Sensibilité-résistance -> Récidive ->Résistance RISQUE Gènes de prédisposition BRCA T790M? EGFRs MET, ALK, BRAF KRAS EGFRr ALKr, ROSr Surrogates Perspectives : 1- Panel V6 : suivi longitudinal 2- Exome / RNA Seq à visée diagnostique sur échantillons FFPE : criblage exhaustif

MERCI! Service de Génétique Moléculaire et Génomique Translational Oncogenomics, UMR6290 CNRS-UR1 Plate-forme INCa BMAlexandra Lespagnol Cécile Chaplais Helena Gourdet Frédérique Guénot Gaelle Moron BIMarie de Tayrac Amyra Aliouat Florent Denoual BAnnick Mosser Marie-Pascale Beaumont Marie-Dominique Galibert Houda Hamdi Marie de Tayrac Plate-forme Génomique environnementale & humaine UR1, Biogenouest, IBiSA Marc Aubry Direction des systèmes d’information CHU de Rennes Christine Pichon Denis Courtel Arnauld Coursin RCP Moléculaire bretonne (Julien Edeline & JM) généticiens dermatologues gastro-entérologues gynécologues pathologistes pneumologues neuro-oncologues neuro-pédiatres… Pole régional de cancérologie