La chromatographie Classification des chromatographies Grandeurs chromatographiques Volume de rétention Résolution Quantification en chromatographie Chromatographie en phase liquide Adsorption Partage Exclusion stérique Echange d’ions Chromatographie en phase gazeuse L’appareillage en chromatographie

Principe de la chromatographie

Classification liquide solide SL gaz GS LL Liquide ionique Liquide gel phénomène Phase mobile Phase stationnaire type adsorption liquide solide SL gaz GS partage LL Échange ions Liquide ionique Échangeur d’ions Echange ions Exclusion stérique Liquide gel exclusion Phase mobile Phase stationnaire type liquide LL solide LS gaz GL GS

Grandeurs chromatographiques Position du pic chromatographique Profil des concentrations Ecart type Etalements

Grandeurs chromatographiques Facteurs de capacité Résolution R: elle caractérise la qualité de la séparation Bonne résolution R>1 Mauvaise résolution R<1

Grandeurs chromatographiques Détermination du nombre de plateaux N grandeur caractérisant le fonctionnement de la colonne chromatographique Dépend des conditions de fonctionnement Détermination expérimentale d

Grandeurs chromatographiques Hauteur du plateau équivalent dépend de la taille des particules de phase stationnaire Dépend du remplissage de la colonne Dépend du débit (d) de phase mobile Equation de Vandemter A: contribution de la diffusion du soluté au travers de la phase stationnaire B/d: contribution dela diffusion du soluté dans la phase mobile Cd: contribution de la résistance au transfert de masse entre les deux phases

Quantification en chromatographie Méthode de la normalisation Simple à mettre en oeuvre, peu adapté aux mélanges complexes Méthode par étalonnage direct Nécessite d’utiliser autant d’étalon que de composés recherchés Nécessite de contrôler rigoureusement le volume injecté Méthode par étalonnage interne Nécessité de rechercher un étalon interne adapté à la composition du mélange à analyser Plus long à mettre en œuvre Permet de s’affranchir du volume injecté

Propriétés des phases stationnaires On distingue Le support: silice ou alumine La phase elle-même Adsorbant Solide à pores calibrés Liquide imprégnant les pores Molécules greffées Fonction organique Échangeur d’ions

Propriétés des supports utilisés en chromatographie Grain de taille 5 à 10 µm Classification de la taille des pores: dp > 50 nm macropore 2< dp < 50 nm mésopore Dp < 2 nm micropore Pour les applications en chromatographie les diamètres des pores varient entre 10 et 20 nm La surface spécifique S est majoritairement due à la surface des pores, elle augmente lorsque la taille des pores diminue Vp: c’est le volume des pores: il augmente lorsque la porosité croit P: porosité P=100 *Vporeux/Vmatériau Vo: c’est le volume entre les grains ou volume mort, il ne dépend que de la taille des grains

Chromatographie en phase liquide

La chromatographie d’adsorption Les phases mobiles utilisées en chromatographie d’adsorption Solvant Force éluante (silice) Force éluante (alumine) Hexane Ether 0.22 0.28 Chloroforme 0.26 0.40 Chlorure méthylène 0.32 0.42 Acétonitrile 0.50 0.65 Méthanol 0.73 0.95 Eau >0.73 >0.95

La chromatographie d’adsorption Pads dépend entre autre de l’énergie d’adsorption de la molécule (cette énergie est lié à la surface occupée par la molécule sur le site d’adsorption) de la polarité de la molécule de la nature de la phase mobile utilisée (Pads croit si pm augmente)

Mode de travail en chromatographie d’adsorption Polarité SiO2, Al2O3 f directe f inverse

Chromatographie d’adsorption Pads dépend de la surface occupée par la molécule et de sa polarité (présence d’hétéroatomes)

Effet de la taille des pores en chromatographie d’adsorption d=4 nm, S= 900 m2.g-1 Une diminution de la taille des pores augmente la surface spécifique et par conséquent le Vr du soluté augmente Une taille trop faible des pores peut entraîner des phénomènes d’exclusion stérique d=6 nm, S= 400 m2.g-1 d=10 nm, S= 200 m2.g-1

log k’S = log Va + b ( Eo – AS eo) + log (Wa / VM) + DES Effet de la polarité de la phase mobile en chromatographie d’adsorption L’effet de la polarité liée à la force éluante eo est donnée par la relation de Snyder log k’S = log Va + b ( Eo – AS eo) + log (Wa / VM) + DES log k’S et par conséquent Vr décroissent lorsque la polarité de la phase mobile croit phenanthrene biphenyl naphtalene benzene

Une augmentation de polarité de la phase mobile diminue Vr Effet de la polarité de la phase mobile en chromatographie d’adsorption Une augmentation de polarité de la phase mobile diminue Vr

La chromatographie de partage Solvant phase mobile Force éluante (alumine) Phase stationnaire Hexane  CH3 Benzène 0.32  f Chloroforme 0.40 Chlorure méthylène 0.42 Acétonitrile 0.65  CN Méthanol 0.95  NH2 Eau >0.95 P augmente

Les différents modes de travail en chromatographie de partage Polarité  CH3  CN  NH2 f directe f inverse

Influence du mode direct ou indirect sur la séparation Mode direct: ps > pm Mode inverse: ps < pm

Effet de la polarité de la phase mobile en chromatographie de partage En mode direct En mode inverse Une augmentation de polarité de la phase mobile diminue Vr Une augmentation de polarité de la phase mobile augmente Vr

La chromatographie par exclusion stérique Vo volume intersticiel Vp volume poreux k coefficient de diffusion du soluté k=1 diffusion totale k=0 exclusion totale Vr R Vp Vo

La chromatographie par exclusion stérique Log M Vr R Vp Vo Détermination des masses molaires moyennes

La chromatographie par exclusion stérique Tailles comparées des diamètres de pores en nm (dp) et du poids moléculaire des composés exclus Adsorption Exclusion stérique 102 1.5.103 104 105 106 107 PM Log dp 1 2 3 4 5 En comparaison la taille des pores des phases utilisées en adsorption se situe entre 4 et 10 nm soit au moins 10 fois plus faible; la tendance à réduire le dp des phases classiques conduit à l’apparition de phénomène d’exclusion pour les molécules de masse ≥ 500.

La chromatographie d’échange d’ion Chromatographie d’échange de cation Équilibre d’échange Chromatographie d’échange d’anion

La chromatographie d’échange d’ion 0 7 14 pH Log P Échange de cation Si pH diminue, Vr diminue Échange de d’anion Si pH diminue, Vr croit pH1 > pH2 pH2 > pH1

La chromatographie d’échange d’ion Elimination de la conductivité de la phase mobile La conductivité de la phase mobile est élevée, elle doit être éliminée pour avoir une meilleure sensibilité dans la détection. Cette élimination se fait grace à l’utilisation d’une membrane échangeuse d’ions par dialyse de Donnan

Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse On utilise comme phase mobile un gaz inerte Il existe deux types de CPG La CPG par adsorption (très peu utilisée) la phase stationnaire est un solide poreux La phase stationnaire est souvent de l’azote La CPG de partage la phase stationnaire est un liquide supporté par un solide poreux La phase mobile est souvent de l’azote