Cytogénétique des tumeurs solides F. Pedeutour UE Cytogénétique germinale et somatique 14 janvier 2010

GENETIQUE ET CYTOGENETIQUE TUMORALE BREF HISTORIQUE -18ème-19ème siècle: -Pott : Environnement cancérigène (suie et cancers du scrotum chez les ramoneurs) -Boveri, von Hansemann : Premières observations d’anomalies chromosomiques dans les cellules cancéreuses -Broca : Cancers héréditaires « Graine et terrain » (« seed and soil ») … -1956: Levan : Premiers caryotypes tumoraux -1959: Nowell et Hungerford : Chromosome “Philadelphie” et leucémie myéloïde chronique. -années 70-80 : Oncogènes, Gènes supresseurs de tumeurs, Découverte d’anomalies chromosomiques spécifiques Caractérisation de gènes de prédisposition aux cancers -années 90 : Progrès techniques : FISH, RT-PCR, CGH -années 2000 : Puces à ADN « micro-arrays », transcriptome cellules souches, micro-ARN, méthylome

Tumeurs « liquides » hématologiques RAPPELS/DEFINITIONS Tumeurs solides / Tumeurs « liquides » hématologiques Tumeurs solides malignes / Tumeurs solides bénignes

Tumeur bénigne Tumeur maligne Bien limitée Mal limitée Encapsulée Non Encapsulée Semblable au tissu d’origine (différencié) +/- semblable au tissu d’origine Pas de destruction des tissus voisins Envahissement des tissus voisins Cellules régulières Vaisseaux normaux Cellules atypiques Vaisseaux anormaux Croissance lente Croissance rapide Pas de récidive locale Pas de métastase Récidive possible Métastase possible

*Principaux types de tumeurs solides malignes RAPPELS/DEFINITIONS *Principaux types de tumeurs solides malignes *Tumeurs épithéliales : carcinomes (glandulaires : adénocarcinomes) les plus fréquentes *Tumeurs mésenchymateuses ou conjonctives : sarcomes, tumeurs des tissus mous et de l’os les mieux étudiées en cytogénétique *Tumeurs neuro-ectodermiques : tumeurs cutanées, cérébrales, des tissus nerveux *Tumeurs placentaires et embryonnaires *Tumeurs des séreuses

TUMEURS ET ANOMALIES CHROMOSOMIQUES ACQUISES La majorité des cancers sont sporadiques (non héréditaires, somatiques)  Cause : altérations de l’ADN d’une cellule somatique sous l’influence de différents facteurs (radiations, virus, tabac, UV, amiante, mutagènes chimiques…) Propagation de ces anomalies acquises de l’ADN aux cellules filles lors de la division cellulaire puis apparition d’autres anomalies Conséquences : dérégulation cellulaire, prolifération +++ , Formation d’une tumeur Perte de différenciation, invasion tumorale métastatique (tumeurs malignes) Etude des anomalies génétiques ACQUISES ou SOMATIQUES Analyse « GENOMIQUE » des cellules tumorales : ADN, ARN (biologie moléculaire) ou chromosomes (cytogénétique tumorale)

FACTEURS GENETIQUES DE PREDISPOSITION Moins de 10% des cancers sont héréditaires : *Cause : présence d’une altération de l’ADN (en général une mutation) dans toutes les cellules d’un individu *Altération souvent héritée d’un des parents, (rarement : constitutionnelle de novo) et transmissible à la descendance * Conséquences : la présence de cette anomalie initiale favorise l’apparition dans une ou plusieurs cellules somatiques d’autres anomalies du génome et la formation de cancers : facteur de prédisposition au cancer Anomalie initiale : GERMINALE ou CONSTITUTIONNELLE Recherche du facteur de prédisposition : analyse ONCOGENETIQUE : enquête génétique familiale (consultation oncogénétique, arbre généalogique) et recherche de mutation ADN et plus rarement d’anomalie chromosomique à partir d’un prélèvement sanguin

Rarement : Cytogénétique APPORT DE LA GENETIQUE/GENOMIQUE EN PATHOLOGIE TUMORALE EN PATHOLOGIE TUMORALE Facteurs de Anomalies acquises Anomalies acquises prédisposition Prélèvement tumoral Prélèvement sanguin (ou autre) Cytogénétique Cytogénétique Biologie moléculaire Cytogénétique moléculaire (extraction ADN, recherche mutation) (FISH) Rarement : Cytogénétique ou Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire (extraction ADN, ARN)

Découverte des oncogènes Le sarcome du poulet peut se transmettre par injection de particules ultra-filtrables (issues d’un broyat tumoral filtré) *Peyton Rous , J. Exp. Med, 1911: Dulbecco : L’agent de transmission est un virus : virus du « sarcome de Rous » Le virus du sarcome de Rous est un retrovirus qui contient 4 gènes : gag (capside) pol (reverse transcriptase) env (enveloppe) src (tyrosine kinase) Prix Nobel 1966 « v-src » contient à lui seul l’activité transformante

*1979, Bishop&Varmus (prix Nobel): un homologue cellulaire de ce gène viral, le gène « c-src » existe de façon normale dans le génome de toutes les espèces animales …Bishop : « les ennemis sont parmi nous » découverte du premier « oncogène » Par la suite : découverte de nombreux autres oncogènes (sis, myb, myc…) par différentes filières : propriétés transformantes cytogénétique… Oncogène : tout gène cellulaire, susceptible de devenir, par suite d'une modification qualitative ou quantitative, un gène transformant, capable de conférer expérimentalement le phénotype cancéreux à une cellule normale eucaryote (effet dominant, entraînant un gain de fonction)

Expression normale d’un gène (régulation fonctionnelle spatio-temporelle) immunohistochimie protéine western blot RT-PCR ADN gene ARN northern blot séquençage FISH PCR méthylation, etc… (régulation épigénétique) CGH Southern blot

* Exemples de modes d’activation d’un oncogène ARN+++ Protéine +++ A G Surexpression : dérégulation par mutation... * A G ARN+++ Protéine +++ Surexpression : dérégulation par translocation... ARN+++ Protéine +++ dmin Surexpression par amplification ou hsr

Oncogènes: principaux mécanismes de gains de fonction 1. Amplification génomique : augmentation anormale du nombre de copies d’un gène ou d’une région chromosomique Augmentation de l’expression des gènes amplifiés Avantage sélectif pour les cellules tumorales Nombreux gènes différents amplifiés selon les types de tumeurs

Finalité de l’amplification génomique: confère un avantage sélectif aux cellules qui en sont le support par accroissement de l’expression de certains gènes ARN+++ Protéine +++ dmin Surexpression par amplification ou hsr

Amplification génomique : circonstances de formation Phénomène physiologique programmé intervenant à certaines étapes de la différenciation et du développement chez certaines espèces animales Drosophile : amplification des gènes codant pour les protéines chorioniques dans les cellules ovariennes pour permettre la constitution de l’enveloppe de l’oeuf Xénope: amplification des gènes codant pour les ARN ribosomiaux (+ de 1000 copies) au cours de l’oogenèse Poulet: amplification des gènes codant pour l’actine lors de la myogenèse

Amplification génomique : circonstances de formation Phénomène d’adaptation à de nouvelles conditions d’environnement par exposition à agent de sélection Bactéries : amplification géniques spontanées ou induites par les antibiotiques Parasites : ex : amplification du gène de multi-résistance pfmdr1 chez plasmodium falciparum résistants à la chloroquine Modèles d’étude in vitro Cellules mammifères in vitro : Utilisation du PALA (N-phosphonacétyl-L-aspartate) pour sélectionner des mutants produisant un excès de la protéine multifonctionnelle CAD (carbamyl-P-synthétase/aspartate transcarbamylase/dihydrorotase) Utilisation du méthotrexate pour sélectionner les mutants synthétisant de la DHFR (dihydrofolate réductase) en excès Amplification du gène MDR (multi-resistance drug)

Chez l’homme : l’amplification génomique est un processus pathologique tumoral Observé dans les tumeurs malignes solides ou hématologiques Niveaux d’amplification très variables : de 4-5 copies supplémentaires par cellule à plus d’une centaine de copies Variétés des régions génomiques amplifiées Mécanismes complexes, encore mal élucidés Depuis 1990 : apport du FISH puis de la CGH, puis de la CGH-array

Mécanismes de formation des unités d’amplification (amplicons) Principalement étudiés dans lignées cellulaires in vitro Plusieurs théories In vivo : probablement plusieurs mécanismes associés, phénomène dynamique et complexe 1.Théories conservatives : sans délétion du locus originel modèle des cycles cassure-fusion-pont ou fission-fusion-pont (breakage-fusion-bridge) Modèle proposé initialement par Barbara Mc Clintock à partir d’observation d’anomalies du maïs

cen Modèle “cassure-fusion-pont” (“breakage-fusion-bridge”) Phase G1 Anaphase cassure chromatidienne cen Réplication fusion Métaphase

Cycle BFB cassure Réplication fusion Cellule fille amplifiée G1 Cellule fille délétée G1

Ce modèle permet d’expliquer : -l’hétérogénéïté de taille des amplicons dans une même tumeur -les structures de type répétitions inversées (palindromes) -les co-amplifications de régions normalement non-juxtaposées sur le génome (non-synténiques) : fusion entre deux chromatides de chromosomes différents

Ce modèle permet d’expliquer : -l’hétérogénéïté de taille des amplicons dans une même tumeur -les structures de type répétitions inversées (palindromes) -les co-amplifications de régions normalement non-juxtaposées sur le génome (non-synténiques) : fusion entre deux chromatides de chromosomes différents

2.Théories non-conservatives : formation d’unités d’amplification extra-chromosomiques Phase G2 dmin excision délétion réplication Phase G1 mitose Cellule fille délétée Cellule fille amplifiée réplication Phase G2 Phase G1 Permet d’expliquer la formation de certains chromosomes dmin. MAIS : On n’observe que très rarement la délétion correspondante du locus originel in vivo. Il a été décrit des dmin formés de gènes provenant de chromosomes différents.

Autres mécanismes proposés : “Pelure d’oignon” : multiples réinitiations de la réplication (réplicons) au cours d’un même cycle cellulaire. N’explique pas l’amplification de grande régions. Non prouvé chez les mammifères. Génération d’épisomes (très petits éléments circulaires) par recombinaison intra-chromosomique au sein d’une boucle de réplication Echanges inégaux de chromatides soeurs Rôle des sites fragiles ? Démontré in vitro sur modèles expérimentaux In vivo? Très nombreux sites fragiles répartis sur l’ensemble du génome Activation d’un site fragile à 1-2 Mb télomérique du gène cible “Permissivité” à l’amplification (ex : altération de p53) et “phénotype amplificateur”

21 12 L’analyse FISH a montré que les hsr contenaient fréquemment des Méthodes d’étude de l’amplification génomique : FISH L’analyse FISH a montré que les hsr contenaient fréquemment des co-amplifications de régions non synténiques : complexité inattendue 12 21 Popovici et al., 2002 Co-amplification des régions 8p21 et 11q13 dans une lignée de cancer du sein M-FISH hsr contenant une co-amplification de séquences des chromosomes 11 et 12 localisées sur un chromosome 12 et un chromosome 21

Gène cible et gènes passagers Amplification d’un gène “cible” ou gène “driver” exemple : -MYCN dans les neuroblastomes -région 11q13 dans les cancers du sein : amplicon EMS1, amplicon CCND1 (BCL1), amplicon GARP Rôle des gènes voisins co-amplifiés? Simples “passagers” passifs? Notion controversée : dépend -de leur niveau d’expression -de la fréquence et du niveau de leur amplification In vitro : phénomène de réduction progressive des unités d’amplification : sélection du gène cible? Mécanisme? Un phénomène d’ancrage nucléaire suivi d’élimination par protrusions nucléaires (“blebs”) et micronuclei a été proposé

Mécanismes de l’amplification génomique : conclusions Les modèles théoriques proviennent d’observation in vitro de lignées cellulaires soumises à des agents de sélection Ces modèles sont indispensables pour donner les éléments de compréhension Le phénomène d’amplification in vivo, dans les tumeurs primaires représentent souvent un phénomène tardif, à la suite de nombreuses divisions cellulaires Les méthodes de FISH ont démontré une complexité insoupçonnée jusqu’alors des remaniements présents dans les amplicons Conclusion : l’amplification génomique est un phénomène dynamique, résultant probablement d’une instabilité du génome, avec combinaison simultanée de plusieurs mécanismes associés et de nombreux remaniements secondaires

Méthodes de détection de l’amplification génomique Méthodes globales (CGH, caryotype) ou méthodes ciblées (Q-PCR, FISH) Méthodes après extraction d’ADN (Q-PCR, CGH) ou méthodes de cytogénétique conventionnelle (caryotype) ou moléculaire (FISH métaphasique ou interphasique)

Méthodes d’étude de l’amplification génomique 1. Après extraction d’ADN : Southern « blots » : migration électrophorétique de l’ADN et transfert sur membrane 1. Extraction d’ADN 2. Coupure enzymatique (enzymes de restriction) 3. Mélange à un colorant et dépôt dans les puits d’un gel d’agarose ADN témoin non coupé Coupure avec Hind III Coupure avec EcoR1 Marqueur de taille

Méthodes d’étude de l’amplification génomique 4. Migration électrophorétique 5. Transfert par capillarité de l’ADN sur membrane (=empreinte du gel) 6. Hybridation avec sonde et révélation (radio-activité ou chimie-luminescence) + - 5 6

Importance de disposer de témoins + et - : -échantillons témoins -sondes témoins pour la calibration du niveau d’amplification Intérêt : Applicable sur tissu frais ou congelé Donne une estimation précise du niveau d’amplification Permet de détecter les remaniements de structure associés Membranes réhybridables plusieurs fois Limites : Nécessite de l’ADN non dégradé en quantité suffisante (non applicable aux tissus fixés inclus en paraffine) Utilisation de radio-activité Recherche ciblée sur certains gènes amplification de gènes de la région 12q14dans les liposarcomes

Extraction d’ADN tumoral Détection de l’amplification par PCR quantitative = Recherche ciblée Quantification relative • Extraction d’ADN Disposer d’amorces oligonucléotides correspondant au gène étudié Réalisable à partir de prélèvement frais, congelé ou fixé et inclus en paraffine • Gène contrôle (albumine) Nombre de copies d’un • gène mdm2 mdm2 lipome liposarcome albumine albumine

Extraction d’ADN: détection d’amplification par CGH conventionnelle Image A. Aurias, Institut Curie Recherche globale Ni gain ni perte

Extraction d’ADN: détection d’amplification par CGH sur puces à ADN Ni gain ni perte Recherche globale Image A. Aurias .

Extraction d’ADN: détection d’amplification par CGH sur puces à ADN Image : A. Aurias

Analyse cytogénétique conventionnelle Méthodes d’étude de l’amplification génomique par cytogénétique conventionnelle ou moléculaire Analyse cytogénétique conventionnelle Amplification « extra-chromosomique » Chromosomes double minutes Forme d’amplification “extra-chromosomique” Petites particules circulaires de chromatine étroitement appariées. Sandberg Hétérogénéïté de taille : parfois petits « diplocoques », parfois petits anneaux, degré de coloration variable Hétérogénéïté de nombre : de quelques uns à plus d’une centaine par cellule. Variation d’une tumeur à l’autre, mais aussi d’une cellule à l’autre dans un même prélèvement.

Chromosomes double minutes Sandberg

Apparemment acentriques : coloration bandes C négatives, Chromosomes double minutes Apparemment acentriques : coloration bandes C négatives, alpha-satellites négatifs Mode de segrégation mitotique particulier : pas d’attachement aux kinétochores. S’attacheraient aux extrémités des autres chromosomes « chromosomes auto-stoppeurs » Répartition au hasard dans l’une ou l’autre des cellules filles. Réplication en phase S précoce : acquisition de la configuration en doublets Relation entre épisome et dmin? Entre dmin et hsr??

Amplification intra-chromosomique hsr : homogeneously staining region L’amplification est insérée au sein d’un chromosome “porteur”, qui peut être ou non le chromosome d’origine de la région amplifiée Sandberg Le chromosome porteur est souvent de grande taille Il est parfois l’objet de remaniements associés rendant son identification difficile : “chromosome marqueur” hsr : grand bloc sans marquage de bandes On observe aussi des : abr : abnormal banded region ecr : extended chromosomal region

Apport du FISH à l’étude de l’amplification génomique FISH métaphasique Amplification de MYCN dans une cellule de neuroblastome : “double minutes” Amplification de MDM2 dans une cellule de liposarcome grand chromosome marqueur (hsr)

Intérêt de la détection de l’amplification en clinique : 3 exemples Centromere chromosome 17 ERBB2 (neu) Coupe de tissu congelé (épaisseur 5µ) d’un carcinome mammaire La surexpression ddu récepteur membranaire ERBB2 dans des cancers du sein est due à une amplification du gène ERBB2 (neu) situé sur le chromosome 17 La surexpression est détectable par immunohistochimie (détection de la protéine produite par le gène). Dans les cas douteux, le FISH est la méthode de référence Intérêt de la détection : les patientes peuvent être traitées par l’anticorps monoclonal anti-ERBB2: Trastuzumab (ou Herceptin) Exemple 1:

Amplification de MYCN dans les neuroblastomes Exemple 2 : Amplification de MYCN dans les neuroblastomes Neuroblastome : tumeur extra-craniale la + fréquente chez l’enfant, 8 à 10% des cancers pédiatriques Age moyen : 22 mois Les formes du nouveau-né régressent parfois spontanément MYCN : gène localisé en 2p24 Amplifié dans diverses tumeurs Dans les neuroblastomes, l’amplification (>10 copies) de MYCN est associée à une progression tumorale rapide, un mauvais pronostic vital, quel que soit l’âge du patient ou le stade de la maladie Observée chez 25% des patients non traités à l’époque du diagnostic. Région cible de l’amplification : environ 130 kb, peut contenir d’autres gènes que MYCN, mais MYCN est le seul à être amplifié et surexprimé de façon constante Amplifié sous forme de dmin ou hsr

Exemple 3 : Amplification du gène MDM2 dans une cellule de liposarcome Coupe fixée (formol) incluse en paraffine Intérêt d’aide au diagnostic : on n’observe pas d’amplification dans les lipomes, qui sont des tumeurs bénignes. La surveillance du patient sera différente selon qu’il s’agit d’un lipome ou d’un liposarcome

Oncogènes: principaux mécanismes de gains de fonction 2. Activation d’un oncogène par remaniement de structure chromosomique Translocation Inversion -Echange de deux fragments chromosomiques avec des points de cassure situés dans ou à proximité d’un oncogène

TRANSLOCATIONS

TRANSLOCATIONS : 2 CASSURES, ECHANGE, PUIS RECOLLEMENT Si présence de gènes (« oncogènes ») au niveau des points de cassure de la translocation : Activation par dérégulation à proximité ou Formation de gènes de fusion anormaux : gènes « chimériques » ou « hybrides »

Exemple de la t(9;22) dans la leucémie myéloïde chronique : Formation d’un gène de fusion anormal BCR-ABL BCR-ABL code pour une protéine anormale à activité tyrosine kinase

EXEMPLE DE LA TRANSLOCATION DANS LE SARCOME D’EWING

Tumeurs de la famille du sarcome d’Ewing -Tumeurs osseuses ou des tissus mous de l’enfant et du jeune adulte (5-20 ans) -Tumeurs à “petites cellules rondes”: aspect histologique aspect en culture cellulaire -Tumeurs chimio- et radiosensibles, 60-70% de survie à 5 ans pour une tumeur localisée -Importance +++ de la (cyto)génétique dans le diagnostic

Sarcome d’Ewing -1984: découverte d’une anomalie cytogénétique spécifique t(11;22)(q24;q12)

t(11;22) et PPNET Découverte d’une translocation t(11;22) identique dans des tumeurs neuroectodermiques périphériques (“PPNET”) considérées jusqu’alors comme des entités différentes du sarcome d’Ewing (tumeurs à petites cellules rondes des tissus mous, tumeur thoracique d’Askin, neuroépithéliomes...) Sarcome d’Ewing et PPNETs ne sont que des manifestations cliniques différentes (localisation anatomique, degré de différenciation) d’un même processus de tumorigénèse corrélé à la t(11;22) Apport de la cytogénétique tumorale à la classification et au diagnostic des SE/PPNET : Définition d’une famille des tumeurs du sarcome d’Ewing Diagnostic correct : conditionne une prise en charge thérapeutique optimale

-1992 : Identification des gènes impliqués dans la t(11;22) -EWS -domaine de liaison à l’ARN -expression ubiquitaire -11q24 -FLI1 -activateur de transcription -expression cellules hématopoiétiques

Formation d’un gène chimérique de fusion EWS-FLI1 Sur le chromosome 22 anormal : portion 5’ proximale de EWS+ portion 3’ distale de FLI1 EWS FLI1 5’ 3’ Produit de fusion : partie N-terminale EWS+ partie C-terminale FLI1(avec domaine liaison ADN) Activateur transcription+++

Diagnostic moléculaire des tumeurs de la famille du sarcome d’Ewing RT-PCR EWS FLI1 ADN tumoral Transcription in vivo ARN tumoral EWS FLI1 Extraction Transcription inverse in vitro (RT) EWS FLI1 ADN complémentaire Amorces spécifiques Polymérisation en chaîne EWS FLI1 Obtention d’une quantité suffisante pour détection EWS FLI1 EWS FLI1 Intérêt : spécificité et sensibilité Inconvénients : -nécessité d’une quantité suffisante d’ARN de bonne qualité, -ne détecte pas les translocations variantes non connues EWS-X? (il faut des amorces spécifiques)

Cytogénétique : si quantité suffisante Aspect des cellules en culture (rosettes ou ballonets) Recherche de t(11;22) (ou anomalie du 22) Intérêt : détection possible d’anomalies non attendues, d’anomalies secondaires FISH interphasique : détection de remaniements de EWS à partir de prélèvements frais, congelés, appositions, ou fixés et inclus en paraffine Sondes “EWSR1” encadrant EWS 5’ 3’ EWS Intérêt : simple, rapide, utilisable sur tout type de prélèvement, permet la détection de tous les remaniements de EWSR1, quelque soit le gène partenaire

La détection des gènes de fusion (gènes chimériques, ou hybrides) résultant des translocations chromosomiques a bouleversé le diagnostic et le suivi des malades leucémies lymphomes sarcomes et depuis peu, carcinomes Détection par RT-PCR ou par FISH

Les translocations chromosomiques peuvent aussi entraîner la dérégulation d’un oncogène sans former un gène de fusion Exemple : dérégulation du gène C-MYC (8q24) résultant des t(8;14) dans les lymphomes de Burkitt C-MYC IGH Expression +++ (14q32) 8q24 Le promoteur du gène des immunoglobulines, normalement localisé en 14q32 mais transporté à proximité immédiate de C-MYC en raison de la translocation t(8;14) entraîne une surexpressionanormale du C-MYC

Oncogènes: principaux mécanismes de gains de fonction 3. Activation d’un oncogène par mutation ponctuelle Exemple des gènes RAS RAS : petite protéine « G » ancrée sur la face interne de la membrane cytoplasmique. Agit sur la voie de signalisation des « MAP-kinases » (entrée en mitose) Mutation codons 12 et 13 du gène RAS : Activation permanente de la protéine RAS Activation permanente de la cascade mitogène Prolifération cellulaire accrue

IV. Les oncogènes : « accélérateurs » du processus de transformation Quel que soit le mécanisme d’activation : amplification, translocation, mutation ponctuelle … Activation anormale d’un gène (proto-oncogène) ayant des fonctions importantes dans la signalisation cellulaire Participation à la cancérisation, en coopération avec d’autres mécanismes

V.Les gènes suppresseurs de tumeurs ou anti-oncogènes : « freins » du processus de transformation * * Inactivation d’un gène suppresseur de tumeur (« anti-oncogène ») par délétion, mutation… un * Perte de fonction Effet récessif Inactivation des deux allèles nécéssaire Prolifération cellulaire

Délétions Perte d’un fragment chromosomique de taille très variable ou terminale ou délétion interstitelle

Délétions Exemple de délétion 2p23 dans un naevus lipomateux Importance de l’utilisation d’une sonde témoin pour diagnostic par FISH

Délétions La délétion est acquise dans les tumeurs sporadiques La recherche du fragment minimal de délétion dans un type de tumeur donné a permis l’identification de gènes suppresseurs de tumeurs Il peut exister aussi une délétion ou une mutation constitutionnelle touchant l’autre allèle d’un gène délété de façon acquise =perte de fonction des deux allèles Hypothèse de Knudson (1971) à partir du modèle du rétinoblastome chez des patients avec délétions constitutionnelles du chromosome 13

HYPOTHESE DE KNUDSON : “TWO-HIT” *1er évènement d’inactivation : perte, mutation... Constitutionnel (=germinal) (présent dans toutes les cellules avant la naissance, souvent héréditaire) ou Somatique (=acquis) (survient dans une seule cellule, au cours de la vie) 1 X ADN germinal ou somatique pas de cancer *2ème évènement d’inactivation : perte, mutation… somatique affectant l’autre allèle du même gène 1 2 X X ADN somatique L’inactivation successive des deux allèles permet la transformation tumorale cancer

HYPOTHESE DE KNUDSON : “TWO-HIT” 1ère mutation constitutionnelle 2ème mutation somatique 1ère mutation somatique 2ème mutation somatique

Obtention d’un caryotype tumoral ANALYSE CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES Obtention d’un caryotype tumoral

PRELEVEMENT TUMORAL Fixation et Culture cellulaire Culture cellulaire Examen Examen Frais, non fixé, non congelé macroscopique macroscopique Milieu de transport stérile Fixation et inclusion en paraffine Congélation Culture cellulaire Culture cellulaire Appositions Extraction Extraction Caryotype Caryotype FISH Examen histologique Examen histologique ADN ADN microscopique microscopique ARN ARN + + Immunohistochimie Immunohistochimie ANALYSE CYTOGENETIQUE ANALYSES DIAGNOSTIC ANATOMO- PATHOLOGIQUE MOLECULAIRES dont puces ADN MOLECULAIRE Principales méthodes classiques d’analyse des cellules tumorales

ANALYSES MOLECULAIRES D N A R N Northern blots cDNA-array (transcriptome) Q-RT-PCR Congélation Southern blots CGH CGH-array Culture cellulaire Blocs RT-PCR d’inclusion PCR Q-PCR en paraffine Culots cytogénétiques fixés Exemples de méthodes moléculaires applicables selon les types d’échantillons tumoraux

FISH Culture cellulaire FISH sur métaphases Cryocoupes Tissu fixé et inclus en paraffine (sauf Bouin) -coupes (4-5 microns) -suspension nucléaire FISH sur noyaux (FISH interphasique) Appositions Méthodes de FISH métaphasique ou interphasique applicables selon le type d’échantillon tumoral

DIFFICULTES DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES

Fusion genes and rearranged genes as a linear function of chromosomes aberrations in cancer Mitelman F, Johansson B, and Mertens F, Nature Genetics, 36: 331-334, 2004 nombre de caryotypes anormaux décrits nombre de gènes de fusion leucémies et lymphomes tumeurs mésenchymateuses épithéliales (carcinomes) 31 901 205 5011 38 6246 29 tumeurs solides

DIFFICULTES DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES Rappel et comparaison : réalisation d’un caryotype sanguin constitutionnel *Simple prélèvement sanguin *Incubation courte (24 à 96 h) ; protocoles standardisés *Obtention rapide d’un grand nombre de cellules en métaphase *Résolution chromosomique de qualité *Si anomalies chromosomiques : anomalies simples (perte ou gain d’un seul chromosome; remaniements structuraux impliquant très rarement plus de deux chromosomes).

DIFFICULTES DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES I. Contraintes techniques de recueil et transport du prélèvement II. Difficultés de culture cellulaire in vitro III. Difficultés d’interprétation du caryotype

CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES I. Contraintes techniques de recueil et transport d’une tumeur solide pour analyse cytogénétique *Prélèvement recueilli au bloc opératoire Aussitôt après l’exérèse, en conditions aseptiques Non fixé, non congelé Déposé dans un tube stérile contenant un milieu de transport adapté (ex: RPMI) Organiser le recueil à l’avance *Taille suffisante du prélèvement *Prélèvement acheminé rapidement au laboratoire à température ambiante Organisation et coût du transport

II. Causes des difficultés de culture cellulaire CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES II. Causes des difficultés de culture cellulaire Petite taille du prélèvement Présence de cellules nécrosées, de caillots sanguins Absence de prolifération ou prolifération très lente in vitro (in vivo : rôle des facteurs de croissance, de la vascularisation, du stroma péri-tumoral…) Croissance prédominante in vitro des fibroblastes du stroma : obtention d’un caryotype normal non représentatif des cellules tumorales

III. Difficultés d’interprétation des caryotypes CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES III. Difficultés d’interprétation des caryotypes 1) Mauvaise morphologie chromosomique exemple1 exemple 2

III. Difficultés d’interprétation des caryotypes CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES III. Difficultés d’interprétation des caryotypes 1) Mauvaise morphologie chromosomique Exemple 3 Exemple 4

III. Difficultés d’interprétation des caryotypes CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES III. Difficultés d’interprétation des caryotypes 2) Complexité des caryotypes Multiples anomalies numériques et structurales, polyploïdie, instabilité, polyclonalité

III. Difficultés d’interprétation des caryotypes CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES III. Difficultés d’interprétation des caryotypes 2) Complexité des caryotypes : multiples anomalies numériques et structurales, polyploïdie, instabilité, polyclonalité Présence de chromosomes « marqueurs » non identifiables

III. Difficultés d’interprétation des caryotypes CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES : DIFFICULTES III. Difficultés d’interprétation des caryotypes 2) Complexité des caryotypes Multiples anomalies numériques et structurales, polyploïdie Image : Alain Aurias, Institut Curie, Paris Présence de chromosomes « marqueurs » non identifiables

AMELIORATION DE L’ANALYSE CYTOGENETIQUE DES TUMEURS SOLIDES I. Amélioration des techniques de culture cellulaire II. Hybridation in situ en fluorescence : FISH sur métaphases III. Méthodes complémentaires d’analyse du génome : Hybridation génomique comparative (CGH) FISH interphasique

Adaptation des techniques de culture cellulaire aux cellules de tumeurs solides Milieux de culture cellulaire appropriés (hormones, sels minéraux, protéines, vitamines…) Adaptation du type de mise en culture aux différents types de cellules tumorales *Culture en suspension ou par sédimentation et adhésion au support *Incubation courte (24/48h) ou culture de plusieurs jours… - Utilisation de la collagénase pour dissociation cellulaire rapide et efficace Arrêt rapide de la culture pour éviter « l’invasion » par les fibroblastes : utilisation de petites chambres de culture sur lames de verre Trouver un équilibre entre prolifération suffisante des cellules tumorales et prolifération minimale des fibroblastes

Dissociation mécanique du fragment tumoral Cytogénétique des tumeurs solides : mise en culture Dissociation mécanique du fragment tumoral (ciseaux, scalpel) Autres tumeurs Tumeurs à petites cellules rondes (PNET, neuroblastomes…) Dissociation enzymatique par collagénase (16 à 72 h) Incubation courte (16 h à 48 h) Cellules en suspension Mise en culture en flacons, et/ou boîtes de Petri (3 à 8 jours) et/ou chambres de culture sur lames Obtention et analyse des cellules en métaphase Colchicine, choc hypotonique, fixation, (étalement), coloration, examen microscopique des mitoses, caryotypage

de l’étude cytogénétique Intérêt de l’étude cytogénétique des tumeurs solides

Intérêt pour le diagnostic et la classification Intérêt de la cytogénétique des tumeurs solides Intérêt pour le diagnostic et la classification *Corrélations fiables entre une anomalie chromosomique donnée et un type ou sous-type de tumeur ex: tumeurs adipocytaires 3 12 WCP 12 t(3;12) lipome bénin Chromosome en anneau 12+ : liposarcome bien différencié

La découverte d’une anomalie chromosomique De la recherche par méthode « globale » (caryotype ) vers des méthodes moléculaires ciblées… La découverte d’une anomalie chromosomique dans un type de tumeur est souvent la première étape vers la découverte d’anomalies spécifiques pouvant ensuite être détectées sans réaliser un caryotype Par exemple : découverte d’une translocation récurrente entre deux chromosomes 2) Identification des gènes au points de cassure 3) mise au point d’un test diagnostic par RT-PCR ou par FISH interphasique pour identifier le gène de fusion anormal

« break apart » FUS 16p11 Normal LPS t(12;16) Exemple : liposarcome myxoïde t(12;16)(q13;p11) Entraîne la fusion de DDIT3 (12q13) avec FUS (16p11) FUS est séparé en 2 parties : sur le 16 et sur le 12

Intérêt de la cytogénétique des tumeurs solides Intérêt pronostique Corrélation entre un type d’anomalie et le degré d’agressivité d’une tumeur ex: amplification de MYCN et neuroblastome = mauvais pronostic, traitement +++ >20 petits chromosomes « double minutes » contenant le gène MYCN

Intérêt thérapeutique Découverte de traitements ciblés Intérêt de la cytogénétique des tumeurs solides Intérêt thérapeutique Découverte de traitements ciblés ex: -inhibiteurs de tyrosine kinase : imatinib mésylate (Glivec) dans LMC, GIST et dermatofibrosarcomes -anticorps monoclonaux : Herceptin et cancer du sein avec amplification du gène her2

Découverte de nouveaux gènes, et compréhension Intérêt de la cytogénétique des tumeurs solides Intérêt fondamental Découverte de nouveaux gènes, et compréhension des mécanismes d’activation oncogéniques

anomalies chromosomiques dans les tumeurs solides Particularités des anomalies chromosomiques dans les tumeurs solides

Anomalies chromosomiques et tumeurs solides Anomalies numériques : Aneusomies : monosomies, trisomies, polysomies Anomalies de la ploïdie (haploïdies, polyploïdies) Exemple : caryotype presque haploïde

Anomalies chromosomiques et tumeurs solides Anomalies numériques : Exemple de cellule polyploïde Polyploïdie : > 100 chromosomes Carcinome de vessie

Anomalies chromosomiques et tumeurs solides Anomalies numériques : Exemple Trisomie 1q, 7, 8, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Tétrasomie 13 néphroblastome

Anomalies chromosomiques et tumeurs Anomalies de structure : Translocations, délétions, inversions, insertions, duplications, amplifications Exemple lipoleiomyome utérin Avec translocation t(12;14) Inversion et délétion 7q

Anomalies chromosomiques et tumeurs Anomalies de structure : Translocation t(1;5) hibernome

Particularités des anomalies chromosomiques tumorales acquises par rapport aux anomalies constitutionnelles congénitales Anomalies constitutionnelles : -simples, affectant un nombre limité de chromosomes -taille limitée des fragments en excès ou manquants (sinon : anomalie non viable) -généralement homogène, rarement mosaïque -jamais d’amplification Anomalies tumorales: -parfois simples, aisément identifiables -souvent complexes, affectant le nombre et/ou la structure de multiples chromosomes, avec présence de chromosomes “marqueurs” -présence possible de plusieurs clones avec anomalies différentes

Le nombre d’anomalies chromosomique est-il en rapport avec l’agressivité de la tumeur ? …pas toujours Certaines tumeurs de haut grade peuvent présenter des anomalies très simples Les tumeurs bénignes présentent des anomalies chromosomiques, parfois nombreuses et complexes Certaines proliférations réactionnelles ou inflammatoires non tumorales peuvent présenter des anomalies (trisomie 7, trisomie 8…)

Trisomie 5 et trisomie 7 dans une synovite

COMPILATION DES RESULTATS DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES TUMORALES Catalog of chromosomes aberrations in cancer (Mitelman) plus de 30 000 caryotypes tumoraux anormaux répertoriés http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman Cancer genome anatomy project (CGAP) diffusion de l’information sur “l’anatomie moléculaire” des tumeurs http://cgap.nci.nih.gov/ Atlas of genetics and cytogenetics in oncology and haematology (université de Poitiers) informations par gènes et par type de tumeur http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer Resources for molecular cytogenetics (université de Bari, Italie) sondes correspondant à des oncogènes disponibles http://www.biologia.uniba.it/rmc/