Etude fonctionnelle de la cellule par Cytométrie en Flux par Frédéric Larbret Hôpital L’Archet - Nice -

les « cluster of diferenciation » ou CD.. Les clusters de différenciation (CD) sont des antigènes exprimés par les populations cellulaires du système immunitaire et déterminent le type cellulaire et éventuellement leur fonction.

Introduction à la cytométrie en flux Origine de la cytométrie en flux : 1934: applicable aux cellules hématologiques (comptage) 1941: développement des techniques d’anticorps couplés 1960: développement des premiers cytomètres Définition : La cytométrie en flux permet l’étude précise de cellules isolées entraînées dans un flux liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, sont analysées une par une en défilant à grande vitesse (plus de 30Km/h) devant une source lumineuse (un laser). Intérêt : C’est une technique rapide qui permet une caractérisation : - individuelle de chaque cellule - quantitative (intérêt statistique) - qualitative (morphologie de la cellule et phénotypage)

Composition d’un cytomètre

1)Système fluidique : Flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser 2) Système optique : Rayon laser et différents filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées 3) Système électronique : - PMT qui capte la lumière émise, - Digitaliseur qui la transforme en signal électrique puis en signal numérique, - Ordinateur qui gère et entrepose les données Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes : 1 2 3

La fluidique Système basé sur le principe de Focalisation hydrodynamique

Le trajet optique Les filtres L’optique séparation des excitations

Principe de fonctionnement d'un convertisseur

Mesure de la frequence de distribution des cellules

Les paramètres analysés 1) Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse : - Forward Scatter (FSC) : la lumière diffractée est collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule) - Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à 90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la cellule. ( = granulométrie de la cellule)

Les paramètres analysés 2) Mesures de signaux de fluorescence : Dépendra du type de fluorochromes utilisés FL1, FL2, FL3… Excitation Emission mesure d’une Intensité de fluorescence MFI Mean fluorescence intensity ( canaux) = canal moyen de l’ensemble des canaux occupés Analyse multiparamétrique : analyse simutanée jusqu’à 17 couleurs

Immunophénotypage en routine Immunophénotypage en routine - La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l’hémopathie maligne la plus fréquente du sujet âgé. - Diagnostic par hémogramme et phénotypage - Orientation des décisions thérapeutiques en fonction des marqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie

Analyse de la mort cellulaire Nombreuses techniques qui correspondent chacune à différentes étapes de la mort cellulaire t Activation des récepteurs Cytochromes C / APAF-1 Réduction du potentiel mitochondrial Activation des caspases Exposition de la phosphatidyl-sérine Changements morphologiques Fragmentation de l’ADN Fas/ Fas L Pic Sub-G1 Annexine V /7AAD Dioc6

Distinction des différentes phases du cycle PI Cyclines Hoechst Pyronine y PI Ki-67

Haut de page Flux calcique

Les protéines fluorescentes

Le tri cellulaire  Formation de fines gouttelettes par vibrations à une fréquence contrôlée du liquide de gaine  formations de gouttes (1 goutte = 1 cellule)  Soumission à un champ électrique, les gouttes sont déviées en fonction du paramètre sélectionné Applications  Tri de cellules GFP après transfection  Tri positif ou négatif de cellules après immunophénotypage (jusqu’à 4 populations simultanément )

Le tri cellulaire  Clonage cellulaire