Dr Sibylle BLANC CCA Hôpitaux pédiatriques de Nice CHU-Lenval Expression du récepteur CX3CR1 et de son ligand, la Fractalkine dans les muqueuses respiratoires des patients atteints d’asthme allergique : une nouvelle cible thérapeutique ? Dr Sibylle BLANC CCA Hôpitaux pédiatriques de Nice CHU-Lenval

Prix SP²A – 2013 Master II Génétique Immunité et Développement – UFR Nice (2013 – 2014) Stage en laboratoire à l’IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire) dans l’équipe du Dr Valérie JULIA (CNRS – UMR 7275)

Introduction : l’asthme allergique Hyperréactivité bronchique Hypersécrétion de mucus Inflammation des voies aériennes IL-4 IL-5 IL-13 Tout d’abord, je vais vous présenter ce qu’est l’asthme allergique. C’est une maladie chronique définie par des phases asymptomatiques, et des phases symptomatiques plus ou moins sévères, qu’on appelle « exacerbations » et qui sont en réponse à un stimulus, notamment des allergènes. L’asthme se caractérise une hyperréactivité bronchique, cad le muscle lisse autour des bronches qui se serre, qui se spasme, et une hypersécrétion de mucus en réponse à une inflammation des voies aériennes. En effet, cette inflammation est caractérisée par un afflux de cellules immunitaires : des mastocytes, des éosinophiles, des lymphocytes B et T, et notamment des lymphocytes CD4+ Th2. C’est l’acteur principal de la pathologie asthmatique, par sa sécrétion de cytokines inflammatoires permettant en autres cette inflammation cellulaire et les symptômes cliniques. A savoir qu’à un stade avancé de la maladie, on observe un remodelage des bronches avec infiltration notamment de polynucleaires neutrophiles. Th2 spécifique de l’allergène

Inhalation de l’allergène Migration des lymphocytes Th2 spécifiques de l’allergène Epithélium bronchique Th2 spécifique de l’allergène

Prolifération des LT Th2 et afflux de cellules inflammatoires HRB et hypersécrétion de mucus, bronchospasme Allergène Epithélium bronchique Lymphocytes B sécréteurs d’IgE Mastocytes Eosinophiles

Expression de CX3CR1 à la surface des Th2 spécifiques de l’allergène Expression de la Fractalkine sur l’épithelium Allergène Epithélium bronchique Fractalkine CX3CR1 CX3CR1 Dès l’arrivée de l’allergène dans les voies aériennes, les Th2 spécifiques de cet allergène migrent dans le tissu pulmonaire, prolifèrent, et se mettent à exprimer à leur surface CX3CR1 = récepteur au chimiokine, dont le ligand est CX3CL1. Cette liaison CX3CR1-fractalkine va conférer à ces lymphocytes un « signal de survie » en inhibant leur apoptose. Th2 spécifique de l’allergène Mionnet et al, Nat Med 2010

Inhalation d’un antagoniste du récepteur CX3CR1 Blocage de la liaison avec la Fractalkine Allergène Antagoniste du CX3CR1 Epithélium bronchique Fractalkine CX3CR1 CX3CR1 Si on fait inhaler un antagoniste de la fractalkine, on sait qu’il va se lier au Rc CX3CR1. Cela va entrainer la mort de ces lymphocytes Th2 spé de l’allergène, et bloquer la réponse inflammatoire, et donc les symptômes asthmatiques. Th2 spécifique de l’allergène Mionnet et al, Nat Med 2010

Mort de ces LT Th2 spécifiques  PAS D’ASTHME Allergène Antagoniste du CX3CR1 Epithélium bronchique Fractalkine CX3CR1 CX3CR1 Th2 spécifique de l’allergène Mionnet et al, Nat Med 2010

Objectifs : qu’en est-il chez l’Homme ? Déterminer si la Fractalkine est exprimée dans les muqueuses respiratoires des patients allergiques Déterminer si les lymphocytes T auxiliaires présents dans les muqueuses respiratoires des patients allergiques expriment à leur surface le récepteur CX3CR1 Les objectifs de mon projet sont basés sur la pathologie asthmatique humaine et visent à déterminer si le couple CX3CR1/fractalkine est-il exprimé dans les muqueuses des voies aériennes chez des patients atteints d’asthme et de rhinite allergique. Sur quels types cellulaires est-il exprimé ? Et si L’expression de ce récepteur est modulée lors des exacerbations : D’origine virale ? D’origine allergique Car on sait que dans l’asthme allergique les symptomes aigues, les exacerbations se déclarent quand exposition à l’allergène mais aussi ors d’infection virale.

Matériel et Méthodes Etude pilote avec le service de pneumologie du Pr C.H. Marquette, du CHU Pasteur à Nice Patients répartis en 3 groupes 18 à 40 ans Non fumeurs 9 patients inclus 2 patients Groupe « sains » 4 patients Groupe « rhinite allergique isolée » 3 patients Groupe « rhinite allergique+asthme allergique »

Endoscopie bronchique Matériel et méthodes Endoscopie bronchique Brossage nasal Brossage bronchique Immunohistochimie Sur lames de cytospin Marquage de la Fractalkine Cytométrie de flux Populations cellulaires Expression de CX3CR1 à la surface des LT CD4+

Résultats  Sains  Rhinite allergique isolée  Rhinite allergique + asthme allergique

La Fractalkine est exprimée au niveau des épithéliums des patients atteints d’allergie respiratoire Isotype contrôle Marquage FKN

La Fractalkine est exprimée au niveau des épithéliums des patients atteints d’allergie respiratoire Isotype contrôle Marquage FKN

La Fractalkine est exprimée au niveau des épithéliums des patients atteints d’allergie respiratoire Isotype contrôle Marquage FKN

Cytométrie en flux Caractérisation des cellules hématopoïétiques LSR Fortessa Brossage nasal Caractérisation des populations cellulaires Brossage bronchique Mastocytes CD4- CD3- CD20- CD117+ Siglec-8- CD16- CX3CR1+ Eosinophiles CD4- CD3- CD20- CD117- Siglec-8+ CD16- Lymphocytes B CD4- CD3- CD20+ CD117- Siglec-8- CD16- Lymphocytes T auxiliaires CD4+ CD3+ CD20- CD117- Siglec-8- CD16-

Les brossages nasaux et bronchiques permettent l’analyse des cellules effectrices de la réaction allergique  Sains  Rhinite allergique isolée  Rhinite allergique + asthme allergique

CX3CR1 est exprimé à la surface d’une fraction de lymphocytes T auxiliaires dans les muqueuses des voies aériennes % des Lymphocytes T auxiliaires CX3CR1+  Sains  Rhinite allergique isolée  Rhinite allergique + asthme allergique

Conclusion Validation des brossages dans l’exploration Des cellules effectrices de la réaction allergique Du couple CX3CR1 - Fractalkine La Fractalkine est exprimée dans les épithéliums nasaux ± bronchiques des patients RA ± AA MAIS son expression parait modulée (exposition allergénique environnementale…) CX3CR1 est exprimé sur une fraction de LT auxiliaires dans les muqueuses respiratoires des patients allergiques MAIS pas de différence entre les patients sains et allergiques

Perspectives Plus grand nombre de patients+++++ Etude longitudinale pour prélèvements à différentes conditions pour chaque patient (stable, exposition allergènes, infection) Exploration de la Fractalkine soluble dans le sang et lavages des fosses nasales (lavages broncho-alvéolaires peu faisables)

Merci de votre attention

FACS = cytométrie de flux 1) Suspension cellulaire 2) Flux cellulaire pressurisé 3) Passage devant la source lumineuse 4) Emission puis collecte des signaux lumineux 5) Traitement des signaux J. Cazareth

FACS : Principes de fonctionnement Paramètres mesurés Phénotype cellulaire: Molécules de surface, protéines intracellulaires, ect… (Intensité de Fluorescence relative émise à 90°) >FL1-2-3…. Granularité/Structure (réfraction de la lumière à 90°) >SSC = Side scatter Taille (diffusion de la lumière dans l’axe) > FSC = Forward scatter Lumière incidente J. Cazareth

FACS : interprétation des résultats NEG = A- B- A+B- Fluo A A-B+ A+B+ Fluo B J. Cazareth

Cytométrie en flux Stratégie d’analyse

Cytocentrifugeuse Cytospin® + IHC Cellules 40 000 cellules par lame Centrifugation Fixation Perméabilisation Ac anti-CX3CL1 couplé à la peroxydase + substrat

Qu’en est-il chez l’Homme ? CX3CR1 est exprimé à la surface de cellules immunitaires Mastocytes, cellules NK, monocytes/macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes T Pathologies inflammatoires et allergiques Migration des cellules NK dans la rhinite allergique Echigo et al, 2004 ; Julia, 2012 ; El-Shazly et al, 2013 Fractalkine Chimiokine : domaine transmembranaire, forme soluble Expression dans pathologies inflammatoires Asthme allergique (LBA, cellules épithéliales et endothéliales péri-bronchiques, muscle lisse bronchique) Dermatite atopique (sang, cellules ) Rimaniol et al, 2003 ; Echigo et al, 2004 ; El-Shazly et al, 2006

Moyenne des nombres de cellules

Biblio infiltration mast cells et Ly Pawankar et al, 1996 : biopsie muqueuse nasale et sang, PAR et CIR 70% de LT : augmentation modeste de CD4+ dans PAR ; augmentation significative de la proportion de γδ CD8 plutôt dans lymphocytes intraépithéliaux CD4 plutôt dans ly de la lamina propria 20% de LB : augmentation significative dans PAR Augmentation des cellules FcεRI dans muqueuse nasale des PAR 2 phénotypes de mast cells en fonction des cytokines sécrétées : es IEMC et LPMC (mucosal MC and connective-tissue MC, chez rat) Nasal mast cells express CD40L  coopération avec LB IgE Andersson et al, JACI 2011 Infiltration de mast cells dans les biopsies bronchiques et TB des patients asthmatiques vs sains

Biblio infiltration de LB et Eo Gould et al, Trends in immunology 2006 Synthèse des IgE par plasma cells ex vivo sur muqueuse nasale de patients atteints de RA saisonnière, sensibilisé au grass pollen  LB infiltrent la muqueuse Braunstahl, AAAAI 2004 Augmentation significative du nombre d’Eo dans la muqueuse nasale et bronchique de patients atteints de RA, 24h après nasal provocation