Identification de nouveaux gènes dans l’infertilité masculine par séquençage exomique et validation par production de souris KO CRISPR/Cas9 et de mutants chez T. brucei Charles Coutton, Clémentine Wambergue, Raoudha Zouari, Jessica Escoffier, Thomas Karaouzène, Véronique Satre, Sylviane Hennebicq, Aminata Touré, Mélanie Bonhivers, Christophe Arnoult et Pierre F. Ray Equipe G énétique, E pigénétique et T hérapies de l’ I nfertilité Assises de Génétique4 Février 2016Cité Internationale Lyon 1

Infertilité o Infertilité : Incapacité pour un couple de concevoir une grossesse après un an d’arrêt de contraception (OMS) o Problème de santé publique o 1 couple sur 8 en France o Cause masculine dans 50% des cas o Infertilité masculine : - Plus de 20 Millions - Multifactorielle - 50% infertilités inexpliquées - Composante génétique Seuls quelques gènes ont été caractérisés 2 Découverte de nouveaux gènes impliqués dans l’infertilité masculine

Différents types d’infertilité  Par anomalies de nombre  Peu de spermatozoïdes dans l’éjaculat : oligospermie  Absence de spermatozoïdes : azoospermie  Par anomalie morphologique : tératozoospermie  Malformations de la tête (macrocéphales, globocéphales)  Malformations du flagelle 3

Tératozoospermie flagellaire o Malformations du flagelle MMAF : M ultiple M orphological A bnormalities of the sperm F lagella 4 FLAGELLE Anomalies de la mobilité TÊTE Human MMAF sperm Mosaïque Flagelle : Absent ou court ± courbé ± enroulé ± irrégulier

5 3 µm Axoneme : - Structure centrale - Mobilité Structure « 9+2 » MMAF : Perte fréquente de la paire centrale de MT Structure Spermatique

Etude initiale  Cohorte de 20 patients MMAF  Cartographie par homozygotie  28% mutations dans le gène DNAH1  72 % : autres gènes impliqués ? Nouvelle étude : 6 Ben Khelifa,M., et al. (2014) American Journal of Human Genetics Identifier et caractériser de nouveaux gènes dans le phénotype MMAF

Processus Experimental 7 SEQUENCAGE EXOMIQUE multicentrique Consanguinité 73 Patients MMAF - Recrutement multicentrique (Tunis, Paris, Tehéran, Grenoble) - Consanguinité (transmission sur un mode autosomique récessif) ANALYSE BIO-INFORMATIQUE homozygotes - Mutations homozygotes tronquantes - Mutations tronquantes CARACTERISATION DES GENES CANDIDATS - qPCR - Immunofluorescence - Microscopie Electronique MODELES ANIMAUX - SOURIS KO : CRISPR/Cas9 - Trypanosoma brucei ARN Interférent IDENTIFICATION de GENES CANDIDATSCARACTERISATION

8 gènes candidats identifiés : 31 patients (42%) DNAH1 retrouvé de nouveau chez 5 patients (7%) Filtres choisis : - Mutations tronquantes homozygotes - Atteignant au moins 2 patients de la cohorte - Expression testiculaire forte - Gènes décrits comme faisant partie du ciliome 2 gènes candidats étudiés - FLAG1: 6 patients (8%) - FLAG2 : 2 patients (3%) 8

o Toutes les mutations trouvées par séquençage exomique ont été confirmées par séquençage SANGER 9 Control Patient mutated in exon 31 T C A G A A A A T T C C T T T T T A A A G C T Reference Sequence exon 31 Del T : décalage cadre de lecture, codon STOP prématuré

Expression des transcrits - qPCR 10 Expression testiculaire >>> Expression autres organes Tissus comprenant des cellules ciliées : Poumon, Cerveau

11 Patient MMAF muté dans FLAG1Spermatozoide contrôle Coupe transversale d’un flagelle de spermatozoïde

12 Patient MMAF muté dans FLAG1Spermatozoïde contrôle Coupe transversale d’un flagelle de spermatozoide Absence de la paire centrale de MT

Obtention en quelques mois : o Plusieurs lignées Flag1 KO o Une lignée Flag2 KO 13 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Collaboration Pr S. NEF, Genève

1/ Infertilité des mâles 2/ Etude des spermatozoïdes FLAG1 : Absence de mobilité spermatique. Phénotype sévère homogène de flagelles courts ( hétérogénéité morphologique observée chez les patients MMAF) FLAG2 : Absence de mobilité spermatique, anomalies morphologiques plus discrètes 3/ Microscopie Electronique 14 Control Mice Sperm KO Flag1 Mice sperm Human MMAF sperm 5µm

Trypanosoma brucei  Protiste flagellé  Afrique  Mouche Tsétsé, Maladie du sommeil  Structure axonémale « 9+2 » 15 Blood stream form parasites

Difficulté d’obtention des Ac anti - Flag pour IF sur spermatozoïdes Surexpression des protéines taguées (myc) 16 Collaboration Mélanie Bonhivers, Bordeaux Parental FLAG2 myc FLAG1 myc flagellummycflagellum myc α - tubulineα - myc Colocalisation des marquages

17 Parental FLAG1 RNAi FLAG2 RNAi FP * * * * * * * * * * Désorganisation sévère de l’axonème flagellaire grossissement

Conclusion FLAG1 et FLAG2 impliqués probablement o Dans la spermatogénèse o Construction / solidité de l’axonème Séquençage exomique : Efficace o Mutations identifiées chez 59% des patients o 7 nouveaux gènes candidats (18 gènes mutés au total) Validation de l’implication de 2 gènes sur 2 modèles animaux o Intérêt CRISPR/Cas9 pour sa rapidité o Intérêt et originalité du modèle Trypanosome 18

Perspectives  Modèles animaux :  Identification des partenaires de ces gènes  Meilleure compréhension de la fonction de ces gènes  Augmentation de la taille de la cohorte et nouveaux exomes  Découverte de nouveaux gènes  Augmentation de l’efficacité diagnostique  Corrélation génotype phénotype  L’exome est le bon outil pour une évolution vers un diagnostic de routine du fait de l’hétérogénéité génétique du syndrome MMAF

20 Equipe GETI : C. Arnoult et P. Ray C. Coutton V. Satre G. Martinez M. Christou Kent T. Karaouzène ZE. Kherraf S. Hennebicq C.Wambergue S. Yassine R. Abi Nahed S. Nef J. Escoffier Cochin : A. Touré TIMC-IMAG, Grenoble: N. Thierry-Mieg Mélanie Bonhivers Patients Recrutment : R. Zouari, Tunis