La méthylation de l’ilot CpG de l’exon 2 du gène POLG : facteur de régulation de la quantité d’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules humaines différenciées? Julie STEFFANN IHU IMAGINE (UMR 1163) Necker-Enfants Malades Hospital Paris, France

CI CII CIIICIVCV c polypeptides ADNmt nuclear DNA > POLG  mtDNA polymerase  dNTP Twinkle POLG1 mtSSB POLG2 Replication de l’ADNmt La mitochondrie

La quantité d’ADNmt par cellule est : En pathologie Modifiable par la présence d’une mutation de l’ADNmt  embryon préimplantatoire (Monnot et al., Hum Mol Genet. 2013)  cellules musculaires (Auré et al., Brain, 2006)  par mutation d’un gène de maintenance de l’ADNmt syndrome avec déplétion de l’ADNmt (POLG, DGUOK, C10ORF2, TK2…) Etroitement régulée au cours du développement Spécifique du type cellulaire  Ovocyte : copies  Lymphocyte : 1000 copies  Spermatozoide : 100 copies St John, 2014 En physiologie  Mécanisme(s) non élucidé(s)

SOURIS (Polg-A) - Présence d’un ilot CpG dans l’exon 2 du gène Polg-A Gène POLG Souris : 17 paires CpG Humain : 15 paires CpG Comparaison des ilots CpG « méthylables » dans l’exon 2 POLG chez la souris et l’homme

- Chez la souris: (Kelly et al., NAR, 2012) méthylation de l’exon 2 du gène polg-A  quantité d’ADNmt tissu-spécifique Chez l’humain : (Lee et al., cell death and disease, 2015) méthylation/déméthylation du gène POLG  module quantité d’ADNmt -cellules souches embryonnaires - cellules cancéreuses Méthylation du gène POLG

Variation de la quantité d’ADNmt dans des cellules différenciées humaines Question PHYSIOLOGIE Fonction -des types cellulaires -du stade de développement PATHOLOGIE - mutation de l’ADNmt - déplétion de l’ADNmt Ou ? méthylation du gène POLG Ou ?

MATERIEL TISSUSTEMOINS MUTATIONS ADNmt MUTATIONS POLG POSTNATALS n=15 3 foies 3 muscles 4 fibroblastes 3 leucocytes 2 spermes n=28 4 foies 18 muscles 5 fibroblastes 1 leucocyte n=17 6 foies 5 muscles 5 fibroblastes 1 leucocyte PRENATALS n=39 13 cœurs 13 foies 13 muscles n=56 19 cœurs 17 foies 19 muscles 1 fibroblastes - -Individus « témoins » n=13 individus postnatals n= 19 fœtus (15-24SA) -Patients porteurs d’une mutation de l’ADNmt n=27 individus postnatals n=19 fœtus(14-22SA) - Patients porteurs de 2 mutations du gène POLG n=14 individus postnatals

1.Extraction ADN 2.Traitement au Bisulfite (conversion C>U si C non méthylé) 3.Deep Sequencing : METHODE : Quantification du ratio de méthylation dans l’ilot CpG du gène POLG par deep-sequencing Séquençage sur MiSeq (Illumina) >100 reads/position (en moyenne : 5000 reads) Illumina Protocol PCR1 PCR2 4.Ratio de méthylation C/(C+T) au 15 paires CpG SEQUENCAGE

Physiologie (1): méthylation POLG selon les tissus Très fort ratio de méthylation du gène POLG (>75%) sur toutes les paires CG quelque soit le tissu étudié sauf le sperme INDEX DE METHYLATION

TEMOINS Postnatals (n=15) 3 foies 3 muscles 4 fibroblastes 3 leucocytes 2 spermes Prénatals (n=39) 13 cœurs 13 foies 13 muscles Très fort ratio de méthylation du gène POLG (>80%) sur toutes les paires CG quelque soit le stade de développement CpG N° Index de méthylation Physiologie (2): méthylation POLG selon les stades de développement

Pathologie (1) : méthylation POLG chez les patients porteurs de mutations de l’ADNmt TEMOINS Foie (n=16) Muscle (n=16) Fibroblaste (n=4) Leucocyte (n=3) Coeur (n=19) MUTATION ADNmt Foie (n=21) Muscle (n=37) Fibroblaste (n=6) Leucocyte (n=1) Index de méthylation CpG Pair Mutation de l’ADNmt  modification méthylation du gène POLG - quelque soit la mutation (12 mutations différentes) - y compris dans les tissus à taux élevés de mutation m.3243A>G m.3359A>G m.8344A>G m.14459G>A m.14487T>C m.14674G>A m.14674T>C m.8993T>G m.9185T>C m.13094T>C m.13513G>A m.13514A>G m.10158T>C m.10191T>C m.10197G>A

Pathologie (2) : méthylation POLG chez les patients porteurs de mutations du gène POLG Invalidation du gène POLG  modification de méthylation de POLG Y compris dans les 4 tissus avec déplétion majeure en ADNmt (<20% contrôles) Index de méthylation CpG Pair POLG n=17 Foie (n=6) Muscle (n=5) Fibroblaste (n=5) Leucocyte (n=1) Témoins n=13 Foie (n=3) Muscle (n=3) Fibroblaste (n=4) Leucocyte (n=3)

Conclusions et perspectives Contrairement aux observations sur modèles: –MURIN (IPS, ESC, cellules différenciées) –HUMAIN (ESC, cellules cancéreuses) la méthylation du gène POLG ne semble pas être un facteur de régulation de la quantité d’ADNmt dans les cellules différenciées HUMAINES: Quelque soit le tissu, ou le stade de développement Non modifié par la pathologie (mutation de l’ADNmt, déplétion) MAIS:  Pourquoi une hyper-méthylation de l’ilôt CpG du gène POLG chez l’humain? (>80% contre 40-70% chez la souris).  Pourquoi la paire 13 est-elle moins méthylée? Conservée chez la souris, mais absence de données sur son état de méthylation.  Quid de l’embryon préimplantatoire humain?

Remerciements Laboratoire de Génétique Moléculaire Institut IMAGINE A. PoulietA. Pouliet H. AjdalH. Ajdal C. BoleC. Bole C. FourrageC. Fourrage F. ToresF. Tores A. RotigA. Rotig A. MunnichA. Munnich J-P. BonnefontJ-P. Bonnefont Hôpital Necker-Enfants Malades