Docteur Anouck SCHNEIDER Laboratoire de Génétique Chromosomique Département de Génétique Médicale IMPACT DE L’ARRAY PAINTING ET DU WHOLE GENOME SEQUENCING EN DIAGNOSTIC CYTOGÉNÉTIQUE : D’UN RÉARRANGEMENT CHROMOSOMIQUE COMPLEXE À UN CHROMOTHRIPSIS 8 èmes Assises de Génétique : Lyon – 3 février 2016

PatientsRCIUDI Troubles (neuro)musculaires Retard de croissance staturo-pondérale MalformationsRemaniement Chromosomique 1?++Cardiaquest(4;9)(q27;p23),t(7;8)(q31.3;p11.2) 2-+++Ophtalmiquest(4;14)(q21;q22) 3-+-t(4;5)(p15.1;p14.3) 4-++-t(2;11)(q32;p14) 5-++-Cyphoscoliosest(Y;2)(q11.2;q37) Ophtalmiques Microcéphalie t(3;7)(q11.2;q11.22) 7-+-t(3;5)(q26;q13.3) 8-+-t(1;14)(q44;q32.2) 9-+-Lésions cutanéest(X;16)(p21.1;q11.2) t(3;15;5)(p11;q2?5;q23) 11-D*+ Cardiaques Cérébrales Microcéphalie t(1;10)(q44;p14) t(4;7)(q26 or q27;p15.3) D* : décédé à 6 mois de vie Cohorte : 12 patients / 11 ans DI ET REMANIEMENT CHROMOSOMIQUE APPAREMMENT ÉQUILIBRÉ

Plusieurs étiologies  Micro-remaniement déséquilibré identifié par l'utilisation de techniques plus résolutives  Interruption d'un gène au niveau d'un ou des deux points de cassure  Effet de position  Formation d'un gène de fusion  Modification d’une région soumise à une empreinte parentale  Mutation génique sans rapport avec la translocation  Cause non génétique

ACPA ACPA : Cytoscan HD™ (Affymetrix®) : haute résolution * 2,69 millions de marqueurs pour l'analyse du nombre de copies CN SNP * Résolution moyenne globale : 1148pb.  Détermination de la zone du point de cassure précise ~ kb Institut de Médecine Régénérative et de Biothérapie – CHRU Montpellier : Véronique Pantesco

DI ET REMANIEMENT CHROMOSOMIQUE APPAREMMENT ÉQUILIBRÉ Plusieurs étiologies  Micro-remaniement déséquilibré identifié par l'utilisation de techniques plus résolutives  Interruption d'un gène au niveau d'un ou des deux points de cassure  Effet de position  Formation d'un gène de fusion  Modification d’une région soumise à une empreinte parentale  Mutation génique sans rapport avec la translocation  Cause non génétique

MARCHE SUR LE CHROMOSOME

ARRAY-PAINTING (AP) Gribble S. et al Cytométrie en flux (CMF)

Whole Genome Sequencing (WGS) : Version ILLUMINA Plateforme MGX, CNRS – Montpellier : Laurent Journot

PatientsRCIUDI Troubles (neuro)musculaires Retard de croissance staturo-pondérale MalformationsRemaniement Chromosomique 1?++Cardiaquest(4;9)(q27;p23),t(7;8)(q31.3;p11.2) 2-+++Ophtalmiquest(4;14)(q21;q22) 3-+-t(4;5)(p15.1;p14.3) 4-++-t(2;11)(q32;p14) 5-++-Cyphoscoliosest(Y;2)(q11.2;q37) Ophtalmiques Microcéphalie t(3;7)(q11.2;q11.22) 7-+-t(3;5)(q26;q13.3) 8-+-t(1;14)(q44;q32.2) 9-+-Lésions cutanéest(X;16)(p21.1;q11.2) t(3;15;5)(p11;q2?5;q23) 11-D*+ Cardiaques Cérébrales Microcéphalie t(1;10)(q44;p14) t(4;7)(q26 or q27;p15.3) D* : décédé à 6 mois de vie Cohorte : 12 patients / 11 ans DI ET REMANIEMENT CHROMOSOMIQUE APPAREMMENT ÉQUILIBRÉ

D’un RCC à un chromothripsis : Patient 10  Naissance : 41 SA, PN à 3650 g, TN à 52 cm et PCN à 32 cm.  Marche à 2 ans avec ataxie  DI, des troubles neuromusculaires et retard staturo-pondéral

Caryotype : Remaniement Chromosomique Complexe (RCC) t(3;15;5)(p11;q2?5;q23).ish t(3;15;5)(wcp5+,wcp15-,wcp3+;wcp15+,wcp5-,wcp3+;wcp5+,wcp3-,wcp15+)  3 points de cassure et 3 chromosomes différents Der(3) Der(15) Der(5) Der(3) Der(15)Der(5)

t(3q;5q distal) et chromosome 7 t(5;15) Chromosomes : X et 7 t(3p;15) AP = séparation des dérivés chromosomiques (CMF)

AP : résultats des séquences du chromosome 3p D’un RCC à un chromothripsis (II) Der(5) Der(3) Der(15)

AP : résultats des séquences du chromosome 5q D’un RCC à un chromothripsis (II) Der(5) Der(3) Der(15)

D’un RCC à un chromothripsis (II)  Remaniement plus complexe Chromothripsis ? AP : résultats des séquences du chromosome 5q Der(5) Der(3) Der(15)

Chromothripsis ? E F «chromo pour chromosome et thripsis pour briser en éclat » (Stephens et al. Cell 2011; Kloosterman et al. Hum Mol Genet 2011) AB C D G H J K L AB C I H L I E F Chromosome normal Pulvérisation et réassemblage des fragments chromosomiques E F AB C D G H J K I H K E I G AB C H I D H J L Chromosome normal Pulvérisation et réassemblage des fragments chromosomiques Chromosome remanié F E

Chromothripsis ? «chromo pour chromosome et thripsis pour briser en éclat » (Stephens et al. Cell 2011; Kloosterman et al. Hum Mol Genet 2011) Tumoral : - 3 à 5 % ( > dans tumeurs osseuses => 25%) - Avantage sélectif et prolifératif (gènes de fusion, inactivation, amplification) - Modèle de l’équilibre ponctué ≠ Modèle gradualiste de l’oncogenèse E F AB C D G H J K L I H K E I G AB C H I D H E J F L Chromosome normal Pulvérisation et réassemblage des fragments chromosomiques Chromosome remanié

Chromothripsis ? «chromo pour chromosome et thripsis pour briser en éclat » (Stephens et al. Cell 2011; Kloosterman et al. Hum Mol Genet 2011) Constitutionnel : - Maladies congénitales avec anomalies cognitives, retard du développement, DI. - Remaniements apparemment équilibrés (translocations, inversions) - Hérité ou de novo (formation germinale) E F AB C D G H J K I H K E I G AB C H I D H J L Chromosome normal Pulvérisation et réassemblage des fragments chromosomiques Chromosome remanié F E

RCC versus Chromothripsis Chromothripsis  Au moins 10 points de cassure avec un réassemblage des fragments de manière « clusterisée » généralement sur un même chromosome  délétion / duplication sans perte d’hétérozygotie  un seul cycle cellulaire RCC  Au moins 3 points de cassure sur 2 chromosomes différents

RCC versus Chromothripsis Chromothripsis  Au moins 10 points de cassure avec un réassemblage des fragments de manière « clusterisée » généralement sur un même chromosome  délétion / duplication sans perte d’hétérozygotie  un seul cycle cellulaire RCC  Au moins 3 points de cassure sur 2 chromosomes différents WGS

* ** séquences localisées sur le chromosome 5 dont l'extrémité paired-end n'est pas localisée WGS Extrémité paired-end sur le chromosome 15 Chromosome 5 Région hypothétique du point de cassure Extrémité paired-end sur le chromosome 3

Remaniements intrachromosomiques WGS

RP11-320M08 (5q34) +5ptel RP11-25P22 (5q35.1) +5ptel Examens complémentaires : FISH

Chromosome 3 Chromosome 5 Examens complémentaires : séquençage Sanger

Chromosome 15 Chromosome 5 Examens complémentaires : séquençage Sanger

Chromosome 5 Séquence L1 Examens complémentaires : séquençage Sanger

3A 3B 3C 3D 3E 3 15A 5D 5E 5F 5A 5B 5C 5G 515 der(3) der(15) der(5) D’un RCC à un chromothripsis 5D 5E 5F 5A 5B 5C 5G 3A 3B 3C 3D 3E 3 15A 5D 5E 5F 5A 5B 5C 5G 515

3A 3B 3C 3D 3E 3 5D 5E 5F 15A 5A 5B 5C 5G 515 5A 5B 5E 3B 3C 5G 5F 5D 3D der(3) 3A der(15) 3E 5C der(5) 15A D’un RCC à un chromothripsis 3A 3B 3C 3D 3E 3 5D 5E 5F 15A 5A 5B 5C 5G 515

D’un RCC à un chromothripsis der(3) der(15) der(5) 3A 3B 3C 3D 3E 15A 5D 5E 5F 5A 5B 5C 5G der(3) der(15) der(5) 5B 5A 3D 3C 3B 5E 5D 5F 5G 15A 5D 3E 3A

AvantagesInconvénients * ~ 1 mois * Interprétation aisée * Technique connue * Difficulté dans la mise en œuvre 1- tri chromosomique 2- appareillage * Quantité de renseignements disponibles * Environ 2500€ pour un patient Lignée lymphoblastique obligatoire Résolution de quelques dizaines de kb Problème diagnostique  Chromothripsis MAIS bonne alternative à la marche sur le chromosome Sanger essentiel  choix des amorces difficile AP = technique d’approche ?

WGS = technique d’approche ? AvantagesInconvénients * Quantité de renseignements disponibles * BM accessoire * 4-6 mois * Difficulté dans la mise en œuvre (disponibilité de la plateforme) * Interprétation complexe (bioinformatique) * Technique en développement * Coût élevé : 2539€ (10X) à 7277€ (30X) < 10  g d'ADN Détection de TOUS les remaniements (équilibrés ou non) Diagnostic de remaniements complexes voire de Chromothripsis Technique idéale ???

Service de Génétique Médicale : Pr David Geneviève Pr Pierre Sarda Dr Nicole Bigi Dr Patricia Blanchet Dr Christine Coubes Dr Marie-José Perez Dr Lucile Pinson Dr Jacques Puechberty Dr Marjolaine Willems Emmanuelle Haquet Laboratoire de Génétique Chromosomique : Dr Franck Pellestor Dr Geneviève Lefort Dr Sylvie Taviaux Pauline Bouret Manon Girard Marie-Laure Grespan Elodie Guagliardo Marie-Claude Guérin Thomas Guignard Marie Ponset Magali Poupinel Patricia Sevaux Jennifer Torrent Magali Tournaire Laboratoire des Maladies Rares et Auto-Inflammatoires : Pr Isabelle Touitou Dr Mouna Barat Dr Vincent Gatinois Dr Guillaume Sarrabay Bruno Dumont Aurélie Faure Gutierrez Muriel Déborah Mechin Equipe MGX, Centre National de Recherche Scientifique : Laurent Journot CHRU Montpellier : AOI 2010 Cytometry Core Facility The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge Bee Ling Ng Remerciements Institut de Médecine Régénérative et de Biothérapie CHRU Montpellier Véronique Pantesco