A dominant mutation in MAPKAPK3, an actor of p38 signaling pathway causes inherited retinal dystrophy with primary Bruch membrane and retinal pigment epithelium involvement. Isabelle Meunier, Béatrice Bocquet, Guy Lenaers, Christian Hamel, Harold Merle, Albert Jean-Charles. 8ème Assises de Génétique Humaine et médicale, Lyon 2016.

M/+ +/+ M/+ +/+ M/+ +/+ M/+ +/+ M/++/+ Epithéliopathie Rétinienne Froissée de la Martinique

M/+ +/+ M/+ +/+ M/+ +/+ M/+ +/+ M/++/+ Identitification de la mutation causale: 1. Exclusion des gènes connus des rétinites pigmentaires de transmission autosomique dominante 2. WES: 4 sujets atteints sur trois générations et un sujet non atteint de plus de 30 ans

3. Analyse des données WES Transmission autosomique dominante à pénétrance complète 4 sujets atteints doivent avoir le même variant hétérozygote Le sujet non atteint ne doit pas avoir le variant « suspect » Vingt-huit variants suspects Phénotype unique : Ce variant ne doit pas être présent dans les bases de données EVS, dbSNP, 1000 Genomes databases… Un gène candidat sur le chromosome 3. Ségrégation familiale (14 sujets atteints, 27 non-atteints)

Gène candidat MAPKAPK3 H.s. K3 HRDVKPENLLYTSKEKD H.s. K2 HRDVKPENLLYTSKRPN M.m. K3 HRDVKPENLLYTSKEKD X.l. K3 HRDVKPENLLYTHKDSN D.m. K2 HRDLKPENLLYTTTQPN C.e. K2 HRDLKPENLLYVTTASN S.c. K HRDLKPENLLYIDKSDE A.t. K HRDLKPENFLFVSKHED O.s. K HRDLKPENFLLLSKDED Alignment of the protein sequences (amino-acid 164 to 180 from MAPKAPK3) including the mutated amino-acid L173P among eukaryotes P

In silico analysis of p.Leu173Pro MAPKAPK3 mutation c.518T>C, p.Leu173Pro Variant non décrit dans les bases de données. Variant pathogène pour les logiciels de prédiction PolyPhen 2 with a score = 1 ( SIFT with a score = 0 ( to interfere most likely with the function of the protein by the align-GVDG program with a GD score = ( mutation causlae pour Mutation Taster with a probability of 0.99 ( Pathogène pour Provean with a score of (provean.jcvi.org).

Variation présente dans les bases de données pour le codon 173 : p.Leu173Phe Fréquence (3/121,384). Pathogène pour PolyPhen 2, SIFT et Provean. Leu and Phe amino acids both have hydrophobic side chains and in terms of protein structure and occurrence of Phe in MAP kinases the p.Leu173Phe should not modified the function and the structure.

Figure made using Pymol ( Crystal structure of MK3 (code PDB3FHR ; Cheng et al., Protein Sci., 2010)

K2 / K3 mRNA ratio Fib.RPE K3 mRNA relative abundance 0,5 1,0 1,5 2,0 2, K2 mRNA relative abundance Ctl. Pat. MAPKAPK3MAPKAPK3-Leu173Pro GFP + DAPI % GFP nuclear localisation ** % multi-nucleated cells MAPKAPK 3 MAPKAPK3-Leu173Pro Tubulin + GFP + DAPI Tubulin + DAPI ABC D E MAPKAPK3 est exprimé dans la choroïde et dans la rétine RPE : MAPKAPK3/MAPKAPK2=0,5 Fibroblastes contrôles (n=3) and sujets atteints (n=2) Pas de difference et MAPKAPK3/MAPKAPK2=0,1 Suggère un rôle spécifique de MAPKAPK3

Microscopie éléctronique de la membrane de Bruch de souris Mapkapk3-/- Bruch’s membrane has a regular and normal thickness below 600nm in 2 month-old wild type mouse (mean value: 451nm ± 73.88nm, red arrows). B: 2 month-old Mapkapk3-/- mouse presents a mean Bruch’s membrane (red arrows) thickness of 516nm ± 204.9nm. Bruch’s membrane thickness (red arrows) is regular in the 6 month-old wild-type mouse (mean 514nm ± 98.29nm). 6 month-old Mapkapk3-/- mouse has a Bruch’s membrane thickness of 857nm ± 663nm.

La pathologie est strictement oculaire RPE : Le déficit de MAPKAPK3 n’est pas compensé par MAPKAPK2 Hypothèse pathophysiologique 1. Anomalie du renouvellement de la Membrane de Bruch par un déséquilibre entre les métalloproteinases (MMP-1,-2,-3,-9) et les “tissue inhibitors of metalloproteinases” (TIMPs), enzymes sécrétées par l’EP et les cellules endothéliales choroïdiennes sous le contrôle de la voie p38 kinases. En accord avec les données OCT des sujets atteints Et les études histologiques des souris

Hypothèses pathophysiologiques 2. Les altérations de la membrane de Bruch et le déséquilibre MMPs/TIMPs vont favoriser les complications néovasculaires et les lesions de Vasculopathies polypoïdales (7 sur 15 patients) 3. La voie p38 est impliquée dans la survie des cellules de l’épithélium pigmentaires d’où l’evolution finale vers une rétinite pigmentaire

Vers des mutations causales rares Une famille - une mutation privée – études fonctionnelles Première implication en pathologie humaine de MAPKAPK3 et de la voie p38 kinases MAPKAPK3 et d’autres phénotypes caractérisés par un épaississement de la membrane de Bruch…