Recyclage anormal du récepteur à la transferrine : un mécanisme physiopathologique commun aux neurodégénérescences avec accumulation en fer Anthony Drécourt Etudiant en thèse Bonjour a tous, Je voudrai remercier le comite scientifique de m’avoir permis de vous présenter mes travaux. Agnès Rötig DR1 Génétique des maladies Mitochondriales Institut IMAGINE, PARIS, France

NBIA : Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation Maladie génétique rare Autosomique récessive ou liée a l’X Prévalence : 1-3/1 000 000 10 gènes connus   « Œil de tigre » IRM PANK2 Dysfonctionnement extrapyramidal progressif Dystonie, rigidité, choréoathétose Détérioration intellectuelle Accumulation de fer : putamen substantia nigra globi pallidi Les NBIA ou Neurodégénérescence avec accumulation en fer dans le cerveau. est une collection de maladie génétiques rares transmises de manière autosomiques récessives ou liées a l X. Avec une prévalence de 1a3 sur 1million. Les patients présentent une accumulation cerebrale DE FER dans les putamens, la subsatnce noire et les globii pallidi. A ce jour il existe 10 gènes de NBIA. Seulement deux d’entres eux la ferritine et la cerruloplasmine ont un role directe dans l’homeostasie du fer. PANK2 le gene majeur de NBIA ainsi que COASY sont impliques dans la synthèse du CoA. FA2H et PLA2G6 sont eux impliques dans le remodelages des phospholipides. Puis 4 autres gènes de fonctions peu connues. Pour le moment le lien entre accumulation en fer et le métabolisme du coA n’a pas été établi. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

NBIA : Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation Maladie génétique rare Autosomique récessive ou liée a l’X Prévalence : 1-3/1 000 000 10 gènes connus   « Œil de tigre » IRM PANK2 Dysfonctionnement extrapyramidal progressif Dystonie, rigidité, choréoathétose Détérioration intellectuelle Accumulation de fer : putamen substantia nigra globi pallidi Par séquençage d’exome dans deux familles nous avons pu identifier 2 nouveaux genes de NBIA. Séquençage d’exome dans 2 familles : 2 nouveaux gènes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

CRAT : Carnitine acétyltransferase Ataxie Surdité Syndrome cérébelleux Accumulation de fer dans le cerveau CRAT : c.962G>A Homozygote SIFT: Deleterious MutationTaster: disease causing Dans la première famille. Chez cette enfant née de parents apparentés présentant une Ataxie, une Surdité, un Syndrome cérébelleux ainsi qu’une Accumulation de fer dans le cerveau nous avons pu identifier une mutation homozygote dans le gène CRAT /Carnitine acetyltransferase/ qui ségrégerait avec la maladie. Cette mutation est prédite pour être délétère par les logiciels de prédiction. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

CRAT : Carnitine acétyltransferase CRAT : c.962G>A Homozygote SIFT: Deleterious MutationTaster: disease causing La mutation est en position 321 /change une Arginine en Histidine/ et est localisee dans un domaine très conserve de l’enzyme au cours de l’ évolution. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

CRAT : Carnitine acétyltransferase CRAT : c.962G>A Homozygote SIFT: Deleterious MutationTaster: disease causing L’arginine 321 établie des liaison H avec les acides amines avoisinants qui sont perdues par la mutation en histidine CE qui pourrait induire une déstabilisation de CRAT. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

CRAT : Carnitine acétyltransferase CRAT : c.962G>A Homozygote SIFT: Deleterious MutationTaster: disease causing Effectivement l’absence de détection de CRAT par WB dans les fibroblastes DE LA PATIENTE démontre que la mutation rend la protéine très instable. C P CRAT Actine WB fibroblastes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

CRAT : Carnitine acétyltransferase CRAT : c.962G>A Homozygote SIFT: Deleterious MutationTaster: disease causing CRAT est une Carnitine acetyltransferase une enzyme impliquée dans la beta oxydation comme d’autre gènes de NBIA tels que PANK2 et COASY. Nous avons donc étudié la betaoxydation dans les fibroblastes. C P CRAT Actine WB fibroblastes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Acylcarnitines (pmol/mg prot) CRAT : ß-oxydation Acylcarnitines (pmol/mg prot) CRAT : c.962G>A Homozygote Apres avoir incubes 6h les fibroblastes avec du palmitoylcarnitine lourd, l’ oxydation du palmitate est suivi par GCMS. Les fibroblastes mutes pour CRAT présentent un déficit de dégradation du palmitoylcarnitine en Acetylcarnitine C2. Afin de démontrer que la mutation de CRAT est bien responsable du deficit de la beta oxydation nous avons sur exprime l’ADNc de CRAT dans les fibroblastes de la patiente. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Acylcarnitines (pmol/mg prot) CRAT : ß-oxydation Acylcarnitines (pmol/mg prot) Transduction : lentivirus CRAT CRAT : c.962G>A Homozygote La sur expression de CRAT permet un retour vers la normale de la quantite d’acetylcarnitine. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Acylcarnitines (pmol/mg prot) Acylcarnitines (pmol/mg prot) CRAT : ß-oxydation Acylcarnitines (pmol/mg prot) Transduction : lentivirus CRAT CRAT : c.962G>A Homozygote Acylcarnitines (pmol/mg prot) Transduction : lentivirus GFP La surexpression d’un vecteur vide GFP n’ impact évidement pas le déficit. Cela démontre que la mutation homozygote de CRAT entraine bien un déficit de la beta oxydation. Les mutations de CRAT sont responsables du déficit en ß-oxydation Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : RALBP1 Eps15 homology domain protein 1 Ataxie, hypotonie Syndrome pyramidal et extrapyramidal Retard des acquisitions, perte de la marche Accumulation de fer dans le cerveau REPS1 : c.232G>C c.338C>A SIFT : Deleterious MutationTaster : disease causing Dans la seconde famille. Chez ces enfants nées de parents non-apparentés présentant une Ataxie, une hypotonie, un Syndrome pyramidal et extrapyramidal, un retard des acquisition et la perte de la marche nous avons pu identifier deux mutation hétérozygotes composites dans le gène REPS1 qui ségrégerait avec la maladie. CES mutations sont prédites pour être délétères par les logiciels de prédiction. La fonction de REPS1RALBP1 Epsin15 Homology domain protein1 est peu connue. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : RALBP1 Eps15 homology domain protein 1 REPS1 : c.232G>C c.338C>A SIFT : Deleterious MutationTaster : disease causing Les mutations V78L et A113E sont situées dans une région très conservee au cours de l’ évolution. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : RALBP1 Eps15 homology domain protein 1 REPS1 : c.232G>C c.338C>A SIFT : Deleterious MutationTaster : disease causing Les fibroblastes de la patiente présente une forte diminution de la quantité de protéine REPS1 suggérant une déstabilisation de la protéine. C2 C1 P REPS1 Actine WB fibroblastes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : RALBP1 Eps15 homology domain protein 1 REPS1 : c.232G>C c.338C>A SIFT : Deleterious MutationTaster : disease causing Les 2 mutations sont situeés dans le domaine EH1 qui est le domaine d’’interaction avec RAB11-FIP2 implique dans le recyclage de récepteurs membranaires dont le récepteur a la transferrine. C2 C1 P REPS1 Actine WB fibroblastes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : Endosome de recyclage Le recepteur a la transferrine est internalise par endocytose clathrine dependante. L’acidification du nouvel endosome forme permet la réduction du Fer et sont relargage dans le cytosol ou il sera stocke dans la ferritine cytosolique et/ou utilise par la mitochondrie. Cet endosome va alors fusionné avec le corps multivésiculaire. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : Endosome de recyclage L’interaction de REPS1 avec RALBP1 d’un cote et RAB11FIP2 de l autre permet le bourgeonnement du corps multi vésiculaire et résulte en un endosome de recyclage. Ce dernier retourne a la membrane permettant le recyclage de la transferrine. Nous faisons l’ hypothèse que les mutations de REPS1 RELENTISSENT le recyclage et donc induisent une accumulation en fer progressive. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : Accumulation en fer Nous avons alors dose le fer après une incubation des fibroblaste dans un milieux riche en fer. Nous observons une accumulation massive de fer dans les fibroblastes de la patiente. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

REPS1 : Accumulation en fer Les mutations de REPS1 sont responsables de l’accumulation en fer La surexpression de l’ADNc sauvage de REPS1 dans les fibroblastes de la patiente permet un retour a la normale de la concentration en fer démontant que REPS1 est le gène de la maladie. Pour comprendre cette accumulation en fer nous avons alors suivi l internalisation puis le recyclage de la transferrine par video-microscopie confocale. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Internalisation de la transferrine 20 minutes de pulse Tf-alexa555 Nous avons tout d’abord suivi pendant 20 minutes l’internalisation de la transferrine marquée. Dans les fibroblaste du patient l’internalisation est équivalente a ce que l on voit chez le contrôle. Contrôle Patient Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Recyclage de la transferrine Nous avons alors suivi le recyclage de cette transferrine au cours d’un chase de 20 minutes. Contrôle Patient Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Recyclage de la transferrine Comme vous pouvez le voir ici la transferrine est recyclée en moins de 4 minutes dans les fibroblastes contrôles alors qu’au bout de 20 minutes elles est toujours présente dans les fibroblastes du patient // Et forme des agrégats. Contrôle Patient 20 minutes de chase Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Recyclage de la transferrine Ainsi les mutations de REPS1 altèrent le recyclage et induisent l’agrégation de transferrine dans les fibroblastes Contrôle Patient 20 minutes de chase Les mutations de REPS1 altèrent le recyclage et induisent l’agrégation de transferrine dans les fibroblastes Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 5 min 10 min 15 min C1 REPS1 Voici le recyclage de la transferrine a des temps donnés dans les fibroblastes fixes du patient REPS1 et de contrôle. Comme dans la video nous observons un ralentissement du recyclage et une agrégation de la transferrine. Ces résultats sont en adéquation avec le rôle de reps1 dans le recyclage de l’endosome. Le deuxième gène que nous avons récemment identifie : CRAT est implique dans la synthese du coa et n’a a priori pas de lien connu avec le recyclage de la transferrine. Toutefois nous voulions déterminer si cette anomalie de recyclage etait spécifique de REPS1 ou commune a d’autres NBIA. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 5 min 10 min 15 min C1 REPS1 De manière surprenante dans les fibroblaste mute pour CRAT nous observons des résultats similaires avec un défaut de recyclage et une accumulation de la transferrine ! CRAT Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 0 min 5 min 5 min 10 min 10 min 15 min 15 min PANK2 Les fibroblastes mutes PANK2 /le gene majeur de NBIA/ impliqué lui aussi dans la synthèse du CoA présentent également un défaut de recyclage et une agrégation de la transferrine. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 0 min 5 min 5 min 10 min 10 min 15 min 15 min PANK2 PLA2G6 Les fibroblastes mutes pour PLA2G6 impliqué dans le remodelage des phospholipides Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 0 min 5 min 5 min 10 min 10 min 15 min 15 min PANK2 PLA2G6 Ainsi que ceux mutes pour C19ORF12 de fonction inconne présentent tous ce même défaut de recyclage. C19ORF12 C19ORF12 Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA Tf-alexa555 DAPI Recyclage de la transferrine dans les autres NBIA 0 min 0 min 5 min 5 min 10 min 10 min 15 min 15 min PANK2 PLA2G6 Recyclage anormal de la transferrine : un mécanisme physiopathologique commun aux fibroblastes de NBIA Ainsi Le recyclage anormal de la transferrine est un mécanisme physiopathologique commun aux fibroblastes de NBIA C19ORF12 C19ORF12 Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Régulation de l’homéostasie du fer dans les fibroblastes NBIA Ce recyclage anormal dans tous les patients NBIA doit forcement induire une accumulation en fer, nous avons donc étudié les principaux acteurs de la régulation de l’homéostasie du fer a savoir le Récepteur a la transferrine qui assure l’entree de fer et les ferritines qui permettent son stockage. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Régulation de l’homéostasie du fer dans les fibroblastes NBIA C1 PLA2G6-2 FA2H PLA2G6-3 C19ORF12 TfR1 Ferritines Actine PLA2G6-1 CRAT REPS1 WB1 fibroblastes WB2 fibroblastes De manière très surprenante dans tous les fibroblastes de NBIA REPS1 CRAT PLA2G6 FA2H C19ORF12 la quantité de récepteur à la transferrine est très augmentées reflétant une entrée massive de fer. Les ferritines elles aussi sont très augmentées reflétant un stockage de fer très important dans les fibroblastes de NBIA. L’augmentation concomitante du TFR et de ferritine est contradictoire puisqu’une quantité importante de fer /et donc de fertitine/ devrait bloquer l’ entrée du fer et donc diminuer le TFR Anomalie de l’homéostasie du fer dans tous les fibroblastes de NBIA Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Régulation de l’homéostasie du fer dans les fibroblastes NBIA C1 PLA2G6-2 FA2H PLA2G6-3 C19ORF12 TfR1 Ferritines Actine PLA2G6-1 CRAT REPS1 WB1 fibroblastes WB2 fibroblastes TfR1 Hoechst C1 PLA2G6 CRAT REPS1 Amnis Imagestream / Cymomètre imageur : fibroblastes Nous avons alors mesure la quantite de TFR localise uniquement a la membrane par Amnis /un cymomètre imageur/ après immunomarquage sans perméabilisation. Nous observons une très nette accumulation de TFR a la surface des fibroblastes PLA2G6, et dans une moindre mesure dans les fibroblastes CRAT et REPS1. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Régulation de l’homéostasie du fer dans les fibroblastes NBIA C1 PLA2G6-2 FA2H PLA2G6-3 C19ORF12 TfR1 Ferritines Actine PLA2G6-1 CRAT REPS1 WB1 fibroblastes WB2 fibroblastes TfR1 Hoechst C1 PLA2G6 CRAT REPS1 Quantité normalisée relative de TfR1 (%) *** n=2<3 La quantification du TFR a la membrane a ete effectue sur 50000 fibroblastes et montre une augmentation tres signifiative pour les fibroblastes REPS1 CRAT PLA2G6 et également pour les PANK2 et C19ORF12. Ainsi bien qu’il y ai une surcharge massive en fer la cellule continue a en faire entrer. Ces résultats montrent pour la première fois une deregulation de l’ homéostasie du fer dans les NBIA. Accumulation de TfR1 à la surface des fibroblastes de NBIA Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Mécanisme physiopathologique commun des NBIA Gene Recyclage de la transferrine Ferritine TfR1 ß oxydation Fer REPS1 ⇘ ⇗ ? Pour conclure, Nous avons découvert deux nouveaux gènes de NBIA Reps1 et CRAT. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Mécanisme physiopathologique commun des NBIA Gene Recyclage de la transferrine Ferritine TfR1 ß oxydation Fer REPS1 ⇘ ⇗ ? CRAT CRAT est implique dans la synthèse de CoA comme d'autres gènes de NBIA: PANK2 and COASY. REPS1 lui, est implique dans le recyclage du récepteur a la transferrine. Cela nous a permis de nous focaliser sur le recyclage de la transferrine et nous avons découvert : Un déficit du recyclage de la transferrine, une augmentation des ferritines et une augmentation du tfr a la membrane induisant une entrée et un stockage de fer anormaux. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Mécanisme physiopathologique commun des NBIA Gene Recyclage de la transferrine Ferritine TfR1 ß oxydation Fer REPS1 ⇘ ⇗ ? CRAT PANK2 Les mutations de PANK2 lui aussi implique dans la synthèse du CoA conduisent aux mêmes anomalies de l’homéostasie du fer. Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Mécanisme physiopathologique commun des NBIA Gene Recyclage de la transferrine Ferritine TfR1 ß oxydation Fer REPS1 ⇘ ⇗ ? CRAT PANK2 PLA2G6 FA2H Il en est de même pour PLA2G6 et FA2H impliques dans le remodelage des phospholipides . Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

Mécanisme physiopathologique commun des NBIA Gene Recyclage de la transferrine Ferritine TfR1 ß oxydation Fer REPS1 ⇘ ⇗ ? CRAT PANK2 PLA2G6 FA2H C19orf12 Et aussi pour c19orf12 de fonction inconnue. Nous avons donc démontré que L’anomalie de recyclage de la transferrine est un mecanisme physiopathologique commun aux NBIA L’anomalie de recyclage de la transferrine est un mécanisme physiopathologique commun aux NBIA Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

? Génétique des maladies mitochondriales U1163 Institut Imagine : Agnès RÖTIG Metodi METODIEV Valérie SERRE Pôle de Biologie spécialisée Hôpital Necker Enfants malades : Jean-Paul BONNEFONT Chris OTTOLENGHI Florence HABAROU GR-Ex U1163 Institut Imagine: Olivier HERMINE Mickael DUSSIOT Génomique et Bioinformatique : Christine BOLE-FEYSOT Patrick NITSCHKE Plateforme d’imagerie : Meriem GARFA-TRAORE Nicolas GOUDIN Cliniciens Hôpital Necker Enfants malades : Arnold MUNNICH Nathalie BODDAERT Isabelle DESGUERRE «Le fer est salutaire»Bourvil ? Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS

? Génétique des maladies mitochondriales U1163 Institut Imagine : Agnès RÖTIG Metodi METODIEV Valérie SERRE Pôle de Biologie spécialisée Hôpital Necker Enfants malades : Jean-Paul BONNEFONT Chris OTTOLENGHI Florence HABAROU GR-Ex U1163 Institut Imagine: Olivier HERMINE Mickael DUSSIOT Génomique et Bioinformatique : Christine BOLE-FEYSOT Patrick NITSCHKE Plateforme d’imagerie : Meriem GARFA-TRAORE Nicolas GOUDIN Cliniciens Hôpital Necker Enfants malades : Arnold MUNNICH Nathalie BODDAERT Isabelle DESGUERRE Anthony B. Drecourt Institut IMAGINE, PARIS «Le fer est salutaire»Bourvil ?