Détection combinée de CNVs et de SNVs par OneSeq : Alternative au Whole Genome Sequencing ? Nicolas Chatron 1,2, Marc Le Lorc’h 3, Eudeline Alix 1, Matthieu Egloff 3, Didier Goidin 4, L. Colleaux 5, Jean-Philippe Jaïs 6, Serge Romana 3, Damien Sanlaville 1,2, Valérie Malan 3,5 1. Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle, Hospices Civils de Lyon 2. Equipe TIGER, CRNL, UCBL1, U1028 INSERM, UMR 5292 CNRS, Lyon 3. Service d‘Histologie, Embryologie et Cytogénétique, Hôpital Necker Enfants Malades 4. Agilent Technologies 5. UMR_S1163, Institut Imagine, Université Paris Descartes 6. Service de Biostatistique, Hôpital Necker Enfants Malades 1 SNVCNV

Stratégie diagnostique Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) Gold standard pour détection de CNVs Mise en place depuis 2007 Première intention dans l’exploration de la déficience intellectuelle et/ou malformations congénitales Taux de CNVs pathogènes détectés: 12%. De plus en plus d’études moléculaires monogéniques sont transférés vers des analyses de panels de gènes ou d’exome. SNV+++ Taux diagnostic pour l’exome dans la déficience intellectuelle et/ou malformations congénitales : 25-40% selon stratégie appliquée CNV : détection possible… 2

ACPA Digestion enzymatique Marquage fluorescent Hybridation - Scanner NGS Fragmentation Capture Séquençage 3 2 techniques 2 plateformes Zone unique Caisson anti-ozone Scanner Presque pas de dry lab Pré / Post PCR Séquenceur Bioinformatique Stockage Le plus souvent : 2 équipes techniques 2 bases de données 2 consentements MAIS 2 informations pré-test Parfois : 2 prélèvements 2 extractions d’ADN 1 seul patient Coût Temps 80% des patients concernés

Solution OneSeq Backbone de sondes sélectionnées (%GC, …) Résolution moyenne 300 kb Résolution kb sur les gènes « ClinGen/ISCA » 4 OneSeq CNV Backbone Focused Exome targets OneSeq Constitutional Research Panel Target 12Mb Centré sur OMIM, ClinVar, HGMD

5 ACPA OneSeq Labeling

Etude collaborative CHU Lyon : NextSeq500 2x75pb paired end 2x 8 échantillons sur une flow cell HighOutput Necker : HiSeq1500 2x100pb paired end 2x 8 échantillons en Mode Rapid Run 7Gb /patient 30 patients + 2 témoins 1 patient sans diagnostic 29 patients porteurs de CNVs et/ou SNVs connus: 32 CNVs connus 28 SNVs connus 6

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8 ?

Résultats SNVs Gènes comprenant un SNV d'intérêt Patient 1SMARCA4 Patient 2HSPG2* Patient 3SOX3 Patient 4WNT10A* Patient 5GLDC*, MCCC1* Patient 6RYR1*, TSC2* Patient 7MED12, RAI1 Patient 8SACS*, DNAH11*, MYH3* Patient 9PLA2G6, CDH23* Patient 19RBM8A Patient 16ASNS Patient 12MECP2 9 Variant détecté mais non annoté par SureCall  ? Variant non détecté car filtré sur la profondeur lors de l’analyse SureCall par défaut ! Exon ciblé mais non couvert Del de 44pb : Faux négatif Surecall Variant non séquencé Avec pipelines « maison » Polyweb (Necker) + Lyon  27/28 variants retrouvés. * 2 SNVs dans le même gène

Résultats : CNVs Détection OK Bornes OK 10 CNV identifié en ACPA

Résultats : CNVs Détection OK Bornes NON 11 CNV identifié en ACPA

Résultats : CNVs Détection : NON 12 ACPA Dup 12q21.33 OneSeq

Résultats : CNVs Détection : NON Dup Xq28 (350kb) chez un garçon (témoin XX) 13 CNV identifié en ACPA

Comparaison pangénomique 14 OneSeq 20 gains 35 pertes 30 LOH CGH-array 7 pertes 4 gains

Résultats : SureCall Problèmes : Bornes Segmentation Faux positifs Sexe patient/ref 15 Bande chromosomique Taille minimale Patient 1 2q37.2q37.3 del 4q35.1q35.2 dup Patient 26 2q14.1q14.3 dup 15q13.3 del Patient 7 3p26.3 del 5q23.1 dup Patient 149p24.3p13.1 gain38800 Patient 22 9q21.1q21.2 del p24.2p13.1 gain mos8600 Patient 24 19p13.2p12 gain mos8350 Patient 28 12q15q Patient 65q23.2 del4400 Patient 411q14.1 del4200 Patient 13 14q31.1q31.3 dup3500 Patient 21 16p13.11 del2660 Patient 11Xq21.31q21.32 del1500 Patient 25 16q23.1 dup1222 Patient 1516p13.11 dup1200 Patient 12 12q21.33 dup1000 Patient 24q31.22q31.23 del994 Patient 317p12p11.2 del980 Patient 515q24.3q25.1 del649 Patient 103q26.31 del565 Patient 19 1q21.1 del445 Patient 813q21.32 dup395 Patient 92p23.3 del314 Patient 20 Xq28 dup265 Patient 17 16q23.1 del hmz162 Patient 27 16q Patient 23 20q13.33 del10 Patient 18 Xp22.13 del mos8 Patient 16 7q21.3 del7 Gain en mosaïque à 15% Sexe patient différent du sexe de la référence ? 300 kb : résolution théorique CNV non détecté par OneSeq Pipeline maison

Résultats in-house pipeline Lyon Analyse réalisée sur 16 patients 2-6 CNVs par patient 1 patient à 46 CNVs : qualité ? Bornes OK Pas de segmentation 16 Bande chromosomique Taille minimale Patient 26 2q14.1q14.3 dup 15q13.3 del q21.1q21.2 del38800 Patient 22 9p24.2p13.1 gain mos8600 Patient 24 19p13.2p12 gain mos8350 Patient 28 12q15q Patient 21 16p13.11 del2660 Patient 25 16q23.1 dup1222 Patient 19 1q21.1 del445 Patient 20 Xq28 dup265 Patient 17 16q23.1 del hmz162 Patient 27 16q Patient 23 20q13.33 del10 Patient 18 Xp22.13 del mos8 Patient 16 7q21.3 del7 Faux négatif (idem pour SureCall) Non vu en ACPA, MLPA, visible si analyse orientée (KCNQ2) Puce ACPA chromosome X 300 kb : résolution théorique

17 OneSeqACPA Gain du bras court du chromosome 9 en mosaïque à 15%

Bilan Technique OK Profondeur médiane = 120x >97% de la cible couverte à 10x Analyse Surecall : non utilisable pour le diagnostic aujourd’hui Problème de temps d’analyse bioinformatique Détection des SNVs imparfaite ET visualisation « non-friendly » Détection des CNVs non satisfaisante Avec pipelines « maison » (Polyweb Necker/Lyon) Meilleurs résultats (bornes des CNVs, CNVs en mosaïque, SNVs) Meilleure spécificité (CNV et SNV) Pas de nécessité de séquencer un témoin (CNV Lyon) Coût 18

La mort de l’ACPA ? 19 Cost per sample CaryotypeACPA Whole Exome sequencing OneSeq Whole Genome sequencing SNV ++ Indel +++ CNV + (>5Mb) LOH +/- (SNP vs CGH) +++ SV +++

Remerciements Laboratoire de Cytogénétique Dr C. Schluth-Bolard Dr M. Till Dr G. Lesca A. Labalme E. Alix Pr D. Sanlaville Service de Bioinformatique Pr P. Roy C. Bardel P.-A. Rollat Farnier Service de Génétique Médicale Pr P. Edery Dr A. Putoux Dr M.-P. Cordier Dr M. Rossi Dr S. Dupuis Girod Dr C. Abel Dr E. Ollagnon 20 Service d’Histologie Embryologie Cytogénétique Pr S. Romana M. Egloff M. Le Lorc’h Dr V. Malan Service de Bioinformatique P. Nitschke Dr J.-P. Jaïs Service de Génétique Médicale Pr A. Munnich Pr S. Lyonnet Pr V. Cormier-Daire Pr J. Amiel Dr M. Rio Dr M. Nizon Dr G. Baujat Dr C. Michot D. Goidin

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In-house pipeline CNV Lyon Analyse des profondeurs de séquençage Elimination des régions < 30xPondération intra-patientPondération par région inter-patient CNV calling : R 1.3 = dup 3 points consécutifs déviants = CNV 22 Si >15 % des régions d’un patient sont détectées CNV  Patient éliminé de la référence

In-house pipeline Analyse des profondeurs de séquençage Elimination des régions < 30xPondération intra-patient Pondération par région inter- patient Obtention d’un ratio 1 = valeur normale 3 points consécutifs déviants = CNV 23 Pour une région si >15 % des patients sont détectés CNV  Région éliminée de la référence

Focused exome Capture : 206€ Quantité de séquençage nécessaire : 1,5-3Gb Target 12Mb OneSeq Capture : 412€ Quantité de séquençage nécessaire : 7Gb Target : 28Mb 24

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Résultats : CNV Détection OK Bornes NON Problème de segmentation 26 CNV identifié en ACPA