ACPA en diagnostic prénatal première intention

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1 ACPA en diagnostic prénatal première intention
Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, AP-HP Laboratoire HEC Jean-Michel Lapierre, Sophie Fontaine, Sylvie Nusbaum, Catherine Ozilou, Valérie Malan, Serge Romana, Michel Vekemans Hôpital Necker

2 Généralités ACPA = Analyse Chromosomique sur Puce à ADN
Puce à ADN: Séquences nucléiques connues déposées (spots) sur un substrat (verre) et organisées en micro-réseaux (microarray) CGH-array: Hybridation Génomique Comparative sur puce à ADN (Solinas-Toldo, 1997) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre Hôpital Necker

3 CGH-array: principe Co-hybridation ADN test-Cyanine5 (patient) et ADN témoin-Cyanine3 (référence) sur un microarray Calcul du rapport des intensités de fluorescence Cy5/Cy3 pour chaque sonde déposée sur la puce (log2ratio) Représentation graphique des données (profils= nuage de points) Interprétation de la déviation du log2ratio pour déterminer les variations du nombre de copies (CNV) de l’ADN test (gains et/ou pertes de matériel chromosomique) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

4 Interprétation Ratio Cy5/Cy3 log2 ratio signification 1 disomie 1,5
disomie 1,5 0,585 trisomie 1,1 0,138 trisomie mosaïque 20% 2 tétrasomie 0,5 -1 monosomie -  nullosomie Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

5 Limites CGH-array Remaniements chromosomiques équilibrés (translocations équilibrées, inversions) Polyploïdies Mosaïques faibles < 20% Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

6 CGH-array: hybridation
Cibles (marquées, en solution): ADN Patient à étudier ADN Témoin Sondes (connues, non marquées): Fragments ADN fixé sur la lame Hybridation Lavages Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

7 CGH-array: processus Echantillons cliniques: extraction ADNs
référence : cellules témoins test : cellules fœtales extraction ADNs microarray marquage RP +Cy3-dUTP marquage RP +Cy5-dUTP co-hybridation lavage + scanner Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

8 Stratégie médicale pour l’ACPA en DPN
Puce oligonucléotidique pan-génome Agilent customisée « PrecytoNEM » oligonucléotides Résolution: 60 Kb Dessinée par Dr V. Malan (Necker) et M. D Goidin (Agilent): Régions enrichies en oligonucléotides: syndromes pathogènes connus tels que 7q11.23 (ELN, GTF21), 9q34 (EHMT1), 17q21.31 (MAPT), 22q11.21 (DGS/VCFS), 22q13.3 (SHANK3). Régions désenrichies: CNVs à pénétrance incomplète et expressivité variable (1q21, 15q11.2, 15q13, 16p13, 16p11.2, 17p11.2, 17q12, Xp22.3) et 26 gènes suppresseurs de tumeur les plus fréquents. Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre Hôpital Necker

9 Indications ACPA 1ère intention ACPA en complément du caryotype
Signe(s) d’appel échographique (SAE) Hyper clarté nucale (HCN) > 3,5 mm ACPA en complément du caryotype Remaniement chromosomique apparemment équilibré Identification d’un marqueur chromosomique Caractérisation d’une anomalie chromosomique Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre Hôpital Necker

10 Résolution d’analyse Grossesses évolutives:
Résolution: 30 oligonucléotides consécutifs (1,5 Mb) Evite la détection des VOUS (variables of unknown significance) CNV de tailles inférieures à 30 oligonucléotides non rapportées sur le rapport d’analyse Grossesses interrompues pour SAE: Résolution: 6 oligonucléotides consécutifs (400 kb) CNV de tailles inférieures à 6 points non rapportées sur le rapport d’analyse. Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre Hôpital Necker

11 Etapes techniques CGH-array
Prélèvements biologiques Extraction ADN (CQ) Marquage ADN et purification (CQ) Mélange d’hybridation Hybridation et Lavages Lecture et analyse informatique Interprétation des résultats (CQ) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

12 Prélèvements biologiques
Liquide amniotique non cultivé (LANC): 3 à 10 ml Culture de liquide amniotique si prélèvement hémorragique Villosités choriales non cultivés (VNC): 5 à 15 mg Sang fœtal: 500 ml Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

13 Extraction ADN Etape délicate pour LANC Facteurs limitants: ADN natif
Quantité suffisante d’ADN absence ARN rapport DO 260/280 nm >1,7 Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

14 Mode d’extraction Solvants organiques Solvants non organiques
Colonnes de résines échangeuses d'ions Billes magnétiques Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

15 Pureté des ADN Mesures spectrophotométriques
DO 260 nm = équimolécularité des ADN R 260/280 nm (protéines, phénol, autres contaminants) = 1,8 à 2 (>1,7 LANC) Contrôle intégrité des ADN gel d’agarose (haut poids moléculaire) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

16 Phénol-Chloroforme (Sambrook et al., 1989)
Technique: micro-méthode en microtube conique 1,5 ml + vol tampon de lyse adapté à la taille du culot cellulaire (100, 150, 200 ml) + Proteinase K (0.25 mg/l) + RNase A (4 g/l) + RNase A/T1 (0,1 g/l - 0,25 units./l) 37°C ON Phénol x1 Chloroforme x3 TE pH 8.0 Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

17 Kits Qiaamp (Qiagen) et Oragene (DNA Genotek)
Chemagic (Perkin-Elmer), automate Maxwell (Promega): liaison réversible de l’ADN (PO43-) à des billes magnétiques (polyalcool +) + tampon d’adsorption Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

18 Qiaamp et Oragene ADN dégradé Rapport 260/280 <1,7
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19 Chemagic (Perkin-Elmer)
Comparaison méthode Phénol-Chloroforme / kits Chemagic Kit DNA Cytopure: 20 échantillons Kit DNA Amniotic Fluid : 10 échantillons Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

20 Résultats Phénol vs Chemagic Cyto Pure
R 260/280 nm 1,72 1,62 DLRS 0,14 0,19 R>1,7 0,1<DLRS<0,15 Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

21 Résultats Phénol vs Chemagic Amniotic Fluid
Amniotic Fluid sans purification Amniotic Fluid + YM30 R 260/280 nm 1,80 1,52 1,72 DLRS 0,11 - 0,12 R>1,7 0,1<DLRS<0,15 Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

22 Profils Phénol vs Chemagic
DLRS: =0.096 Phénol-chloroforme Chemagic + YM30 R 260/280 = 1,65 DLRS = 0.15 DEB Sev Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

23 Profils Phénol vs Chemagic
DLRS = 0,1 Phénol-chloroforme Chemagic + YM30 R 260/280 = 1,84 DLRS = 0,095 TOU Syl Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

24 Profils Phénol vs Chemagic
DLRS = 0,089 R 260/280 = 1,67 DLRS = 0,22 Phénol-chloroforme Chemagic + YM30 GAR Mal Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

25 Marquage ADN Random Priming
Kit Genomic DNA Labeling Suretag (AgilentTM) ADN référence: Promega Quantité ADN: 350 à 500 ng Purification: colonne Microcon YM30 (Millipore) Quantification Cyanine 3 et 5 (Nanodrop) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

26 Mélange d’hybridation Hybridation
Mélange Cyanine 5 et Cyanine 3, ADN cot-1, tampon d’hybridation Hybridation sur microarray PreCytoNEM Agilent 2x, 4x et 8x 20 heures dans four 67°C Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

27 Lavages post-hybridation
Tampons de lavage 1 et 2 Agilent Caisson anti-ozone (Biotray) Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

28 Lecture et analyse informatique
Capture fluorescence Cyanine 3 et Cyanine 5 (scanner Agilent) Analyse informatique (logiciel Cytogenomics) Transformation des données brutes Profils Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

29 Contrôle qualité FE Bruit de fond Cy3 et Cy5: <10 - >20
Intensité des signaux: >150 - <50 Signal/BF: >100 - <30 Calcul log2ratio Cya5/Cya3 DLRS (derivative log ratio spread): <0,2 - >0,3 Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

30 Analyse technique Evaluer les CQ (0,10< DLRS <0,15 en moyenne)
Ne pas rapporter les CNVs d’une taille inférieure à 30 points Regarder rapidement les profils pour détecter une éventuelle mosaïque Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre Hôpital Necker

31 CGHa mosaïque chrom. 9 normal trisomie 9 en mosaïque
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32 FISH mosaïque Tri 9 dans + 50% des cellules non cultivées
Tri 9 dans 5% des cellules cultivées Tri 9 non détectée sur 20 mitoses Trisomie 9 en mosaïque Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

33 Bilan CGHa DPN 1ère intention
Année CGHa DPN 1ère intention % CNVs pathogènes 2012: (avril 2012) 244 7% 2013: 350 10,3% 2014: 432 10,7% 2015: (données extrapolées) 420 9,3% Total: 1446 9.3% Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

34 Conclusion Stratégie médicale (PrecytoNEM, résolution d’analyse)
Utilisation Phénol-Chloroforme Qualité ++ et Reproductibilité ++ Rendu résultat 2 à 5 jours CNV pathogènes 9% Attentif aux éventuelles mosaïques Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre

35 Equipe Plate-forme CGH-array
remerciements: Sophie Fontaine Jean-Michel Lapierre Valérie Malan Sylvie Nusbaum Catherine Ozilou Serge Romana Michel Vekemans Hôpital Necker-Enfants Malades, AP-HP, Paris; Laboratoire NEM. ACPA prénatal 2015: JM - Lapierre