CELULES SOUCHES (Daniel Aberdam) 2012 9h-12h Je 8/3: cours 1: Définitions et généralités sur les CS Je 15/3: cours 2: CS embryonnaires: modèle et thérapie Je 22/3: cours 3: CS pluripotentes induites (iPS) Je 29/3: cours 4: CS adultes et physiopathologie Je 5/4: cours 6: examen

A quoi sert une cellule souche ? Régénération / Réparation

auto-renouvellement illimité des cellules souches somatique division symétrique prolifération illimitée auto-renouvellement

cellules progénitrices (d'amplification transitoire) souche cellules progénitrices (d'amplification transitoire) cellules différenciées 1. auto-renouvellement 2. prolifération 3. différenciation Tissus à renouvellement rapide: Tissus ne se renouvelant pas ou peu: épiderme (2-3 semaines) muscle (satellites) intestin (108 cellules/jour) cerveau cellules sanguines (1012 globules/jour) foie (cellules ovales) cœur (?)

(> 200 types cellulaires) (ne se reproduisent pas) embryon pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches embryonnaires (ES) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) œuf fécondé (jour 1) stade 8 cellules (3 jours) Totipotentes (> 200 types cellulaires) (ne se reproduisent pas) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes Embryon de 6 semaines cellules foetales ou multipotentes cellules souches de sang de cordon Multipotentes Nouveau-né Cellules de carcinome embryonnaire (EC) Pluripotentes Tératocarcinome (cellules tumorales testiculaires) cellules souches adultes Multipotentes et unipotence adulte

Reprogrammation cellulaire (Yamanaka 2007) œuf fécondé (jour 1) embryon pré-implantatoire trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) œuf fécondé (jour 1) stade 8 cellules (3 jours) Reprogrammation cellulaire (Yamanaka 2007) adulte

A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ? Thérapie des grands brûlés

Reconstitution du système immunitaire A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ? NK B Mo PN Dend GR Meg CS hématopoïétique Lignées hématopoïétiques T Thérapies liées au système hématopoïétique (ex. leucémie) 1000 rads Greffe de moëlle ou autre tissu Reconstitution du système immunitaire 6 mois Till & Mc Culloch, 1961

? La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires ?

La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires - Transfusion de globules rouges Remplacement très transitoire Efficacité immédiate

La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires Remplacement permanent de l’ensemble du tissu- Efficacité retardée - Cellules souches hématopoïétiques Cellules souches épidermiques MAPC? CS mésenchymateuses? - Transfusion de globules rouges Remplacement très transitoire Efficacité immédiate

La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires Remplacement permanent de l’ensemble du tissu- Efficacité retardée - Cellules souches hématopoïétiques Cellules souches épidermiques MAPC? CS mésenchymateuses? Remplacement transitoire des tissus Efficacité rapide - Progéniteurs endothéliaux , myoblastes - Progéniteurs ilôts b de Langherans Précurseurs ostéoblastiques / chondroblastiques Neurones foetaux - Transfusion de globules rouges Remplacement très transitoire Efficacité immédiate

Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches. 1 Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches ? 1. Etude des mécanismes de différenciation 2. Evaluation d’un potentiel thérapeutique 3. Comprendre des pathologies liées à l’auto-renouvellement et à la différenciation (cancer).

Plasticité des cellules souches Invertébrés: hydre Regénère même sa tête!! Persistence d’une niche de cellules totipotentes, recrutées en cas de lésion. Cnidaires: méduses, les coraux, les anémones de mer et autres polypes. Coupé, formera autant de vers complets!! plathelminthe: vers plats

Plasticité des cellules souches Vertébrés: Cicatrisation (Days 1-2) Dé-differenciation (Days 3-12) Formation du blastème (Days 13-21) Re-différentiation (Days 22-40) salamandre (régénère tous ses membres (œil, queue, portions de cœur) amphibiens nocturnes, de l’ordre des urocèles Les cellules à proximité de la lésion (surtout fibres musculaires) se dédifférencient pour former un blastème régénératif contenant des progéniteurs mésenchymateux.

Plasticité des cellules souches Differentiation Morphallaxis (allaxis= exchange) Hydre La régénération d’une partie du corps se fait par une réorganisation cellulaire et structurale avec un nombre restreint de nouvelles cellules (pas de prolifération) Cellules souches totipotentes Differentiation Proliferation Epimorphosis Salamandre Cellules souches ou progénitrices Dedifferentiation recrutement de néoblastes hors de l’organe blessé (forte prolifération)

A quoi est due cette incapacité régénératrice chez l’Homme? Absence de persistence de cellules totipotentes? (Hydre) Limitation du niveau de dédifférenciation? (Salamandre) Et pourtant …….

“Transdifférenciation (plasticité)” CŒUR cardiomyocytes PEAU Kératinocytes Fibroblastes Adipocytes (liposuccion) astrocytes neurones oligodendrocytes Précurseurs neuronaux CERVEAU MOELLE OSSEUSE CSH Brain to blood ! Révolution de dogmes: - passage au travers des feuillets embryonnaires ? -potentiel en médecine régénératrice ? PANCREAS (Seaberg 2004 Nat Biotech Choi 2004 Stem cells) pancreatic endocrine ß-, - and -cells, pancreatic exocrine, stellate cells FOIE hépatocytes Muscle squelettique Cellules endothéliales Chondrocytes ostéocytes

Protocole date de 1961 mais la plupart de ces observations faites entre 1999 et 2004!!!!! 1000 rads Greffe de moëlle ou autre tissu Observation dans les différents tissus chez la souris et post mortem chez l’homme (receveur de greffe de MO) 6 mois Till & Mc Culloch, 1961

Thérapie cellulaire: Réparer une fonction déficiente Reconstitution du tissu d'origine Reconstitution d'un tissu autre que celui d'origine (plasticité) Skeletal muscle

? + Plasticité des cellules souches? cellule ES adulte (somatique) La cellule souche embryonnaire : - est capable de proliférer à l’infini (auto-renouvellement) - est capable de produire tous les types cellulaires (pluripotence) - exprime des gènes qui lui permettent de rester indifférencée (auto-renouvellement et pluripotence) ectoderme mesoderme endoderme neurones, kératinocytes muscles, lymphocytes, adipocytes, endothéliales,... hépatocytes, intestinales, thymus,... ES cellule adulte (somatique) « rajeunie » ? +

? + Promoteur gène d’intérêt Plasticité des cellules souches? cellule adulte (somatique) « rajeunie » ? + Comment reconnaitre les cellules d’origine? Promoteur gène d’intérêt contrôle l’expression du gène contrôle l’intensité de l’expression contrôle le lieu d’expression (tissu-spécifique) activateur répresseur co-facteurs

oct-4 vertes ? PuroR ? Plasticité des cellules souches? sox-2 Promoteur oct-4 EGFP nanog Promoteur oct-4 oct-4 oct-4 est essentiel pour maintenir les cellules ES à l’état indifférencié. vertes ? PuroR ? cellule neuronale Puromycine

Apparition de cellules PuroR et vertes !!!! Promoteur oct-4 EGFP Puromycine Cellules ES Ganciclovir antiviral (CMV) est activé par la Thymidine Kinase (TK) du virus de l’herpes simplex: devient toxique (triphosphate). Promoteur fort Hygromycine TK Cerveau Apparition de cellules PuroR et vertes !!!! + Puromycine (après 2-3 semaines)

Pathologie létale du métabolisme hépatique Absence de l’enzyme Fah (fumarylacetoacetate hydroxylase) Réversion phénotypique par transplantation de CSH (Wang et al. (2003) Nature 422, 897-901) (Vassilopoulos et al. (2003) Nature 422, 901-904) Monocyte fah+/+ Pas d’expression dans cell hématop FAH Souris fah+/+ Hépatocyte

Greffe de Cellules Souches Hématop fah+/+ (c-kit+Lin-Sca1+) Hépatocyte B fah-/- Cytolyse Mort Souris fah -/- Souris fah+/+ FAH Guérison ? Hépatocyte fah+/+ Monocyte fah+/+ FAH Pas d’expression dans cell hématop FAH : fumaroacetate hydroxylase

Greffe de Cellules Souches Hématop fah+/+ (c-kit+Lin-Sca1+) Hépatocyte B fah-/- Cytolyse Mort Souris fah -/- Souris fah+/+ Fusion Mo A fah+/+ X hépatocyte B fah-/- Hépatocyte fah+/+ Monocyte fah+/+ Facteurs régulateurs FAH Pas d’expression dans cell hématop FAH Guérison FAH : fumaroacetate hydroxylase

Fusion cellulaire Cellule hybride polyploïde Division réductionnelle

Malheureusement, l’Homme n’est ni une hydre, ni une salamandre… Contaminant de cellules circulantes Population hétérogène (non clonale) Rareté des CS adultes Fusion cellulaire

Difficultés de démontrer qu’une cellule est souche: Nécessité de caractériser sa descendance in vitro et/ou in vivo (vérification indirecte et rétrospective) mais: Placer la cellule dans des conditions expérimentales qui lui permettent d’exprimer toutes ses capacité de prolifération et de différenciation: Comment le faire puisqu’on ne connaît pas a priori ces conditions!! Comment être sûr qu’on altère pas les propriétés des CS en les manipulant? Analyser ces cellules individuellement (à l’échelle clonale) à cause de l’hétérogénéité des tissus d’origine et l’impossibilité des purification à homogénéité des cellules souches.

Stratégies de réparation tissulaire par des cellules souches Stimulation de cellules souches tissulaires endogènes (spontanée ou induite) Apport de cellules souches généralistes exogènes (voie systémique ou locale) Amplification/stimulation ex vivo de cellules souches endogènes

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE Le transporteur “ATP-binding cassette transporter” expulse le colorant vital. Excitation à 350 nm (UV) Emission fluorescence à 2  différents. Hoechst red (675 nm) Verapamil (inh. du transporteur ABC) Hoechst blue (440 nm)

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES: EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE cellules différenciées assise basale (couche proliférative) Injection de 5-bromo-deoxyuridine (BrdU), BrdU remplace la dT 4 semaines de chasse sans BrdU Impossible chez l'homme (greffe)

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE Ensemencement en condition diluée paraclone méroclone holoclone

épiderme Cellule souche derme Mesenchymal connective tissue

Localisations principales des kératinocytes clonogeniques (BrdU, 3H-Thy) clonogénicité glande sébacée faible activité mitotique in vivo forte activité clonogénique in vitro bulge forte activité mitotique in vivo faible activité clonogénique in vitro bulbe

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE 1000 rads Greffe de moëlle Reconstitution d’un système hématopoïétique Contribution tissulaire 6 mois Till & Mc Culloch, 1961 Traitement des leucémies (pathologies du système hématopoïétique)

Multipotence des cellules souches épidermiques 10 semaines épiderme glande sébacée follicule pileux multipotence Transplantation in utero d'un bulge ß-gal Transfert du greffon sur souris nude

Plusieurs classes de cellules souches épidermiques Ghazizadeh and Taichman (2001) Embo J 20,1215-1222 En condition de réparation ou également en situation physiologique ?

Comment identifier les cellules souches adultes ? EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE EVIDENCES INDIRECTES : CD= cluster designation CSH CD7+ Lymphocyte T Natural Killer CD19+ Lymphocyte B Monocytes CD13+ Polyneutrophiles Cellules dendritiques Hématies CD41+ Mégacaryocyte (plaquettes) CD34+ DR- CD38- CD33- CD34+ DR+ CD38 + CD3 + CD34-

Le concept de "niche" Notch Wnt (ß-caténine/LEF1) c-Myc BMPs épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur multipotent cellules différencées Cellule souche Influence réciproque

cellules différencées épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur unipotent cellules différencées Cellule souche

Squamous cell carcinoma cancers cutanés Papilloma & Squamous cell carcinoma (Ras, p53, PTEN) épiderme Sebaceous Adenoma (LEF-1, MSH2) Basal cell Carcinoma (SHH, p53) derme Trichofolliculoma (ß-caténine, PTEN) & Pilomatricoma

Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)

Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC) (Jiang et al. Nature 2002 418, 41-9) Conversion à l’échelon clonal des MAPC en: cellules endothéliales, ectodermiques et endodermiques, in vitro et in vivo