Etude fonctionnelle de la cellule par Hôpital L’Archet - Nice - Etude fonctionnelle de la cellule par Cytométrie en Flux par Frédéric Larbret

Introduction à la cytométrie en flux Origine de la cytométrie en flux : 1934: applicable aux cellules hématologiques (comptage) 1941: développement des techniques d’anticorps couplés 1960: développement des premiers cytomètres Définition : La cytométrie en flux permet l’étude précise de cellules isolées entraînées dans un flux liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, sont analysées une par une en défilant à grande vitesse (plus de 30Km/h) devant une source lumineuse (un laser). Intérêt : C’est une technique rapide qui permet une caractérisation : individuelle de chaque cellule quantitative (intérêt statistique) qualitative (morphologie de la cellule et phénotypage)

Composition d’un cytomètre

Composition d’un cytomètre 1 3 2 Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes : Système fluidique : Flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser 1 3 2) Système optique : Rayon laser et différents filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées 3) Système électronique : - PMT qui capte la lumière émise, - Digitaliseur qui la transforme en signal électrique puis en signal numérique, - Ordinateur qui gère et entrepose les données 2

La fluidique Système basé sur le principe de Focalisation hydrodynamique

séparation des excitations L’optique séparation des excitations Le trajet optique Les filtres

Système électronique Conversion des signaux optiques en signaux électriques par des photomulitiplicateurs (PMT) Analyse du pulse en Height (H), Width (W) et Area (A) Envois des données sous forme informatique, gérées par un logiciel d‘analyse (CellQuest ou Diva) Laser t Voltage 1. 2. 3. Pulse area(A) Pulse Height (H) Voltage 40 Pulse Width (W) Time (µs)

Les paramètres analysés 1) Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse : - Forward Scatter (FSC) : la lumière diffractée est collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule) - Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à 90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la cellule. ( = granulométrie de la cellule)

Les paramètres analysés 2) Mesures de signaux de fluorescence : mesure d’une Intensité de fluorescence MFI Mean fluorescence intensity (256-1024 canaux) = canal moyen de l’ensemble des canaux occupés Dépendra du type de fluorochromes utilisés FL1, FL2, FL3… Excitation Emission Analyse multiparamétrique : analyse simutanée jusqu’à 17 couleurs

Fluorochromes et compensations Importance dans le choix des combinaisons de fluorochromes FL2 - %FL1 AVANT APRES

Immunophénotypage en routine - La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l’hémopathie maligne la plus fréquente du sujet âgé. - Diagnostic par hémogramme et phénotypage - Orientation des décisions thérapeutiques en fonction des marqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie

Analyse de la mort cellulaire Nombreuses techniques qui correspondent chacune à différentes étapes de la mort cellulaire Dioc6 Fas/ Fas L Activation des récepteurs Cytochromes C / APAF-1 Réduction du potentiel mitochondrial Annexine V /7AAD Activation des caspases Exposition de la phosphatidyl-sérine Pic Sub-G1 Changements morphologiques Fragmentation de l’ADN t

Distinction des différentes phases du cycle Cyclines PI Pyronine y Ki-67 Hoechst PI

Flux calcique Haut de page  

Les protéines fluorescentes

Les protéines fluorescentes

Applications Le tri cellulaire Formation de fines gouttelettes par vibrations à une fréquence contrôlée du liquide de gaine formations de gouttes (1 goutte = 1 cellule) Soumission à un champ électrique, les gouttes sont déviées en fonction du paramètre sélectionné Applications Tri de cellules GFP après transfection Tri positif ou négatif de cellules après immunophénotypage (jusqu’à 4 populations simultanément )

Le tri cellulaire Clonage cellulaire