Mediators of Glioblastoma Resistance and Invasion during Antivasculair Endothelial Growth Factor Therapy Agda K. Lucio-Eterovic et al Clinical Cancer Research 6,747 UE BIO 42.a : De la cellule normale à la cellule cancéreuse Tristan RAOULT et Marie DONZEL, 10 février 2011

Plan

Glioblastome [1] Deorah S et al. Trends in brain cancer incidence and survival in the United States: Surveillance, Epidemiology, and End Results program, 1973 to 2001.Neurosurg Focus ( 20:1–7). [2] Davis FG, et al: Survival rates in patients with primary malignant brain tumors stratified by patient age and tumor histological type: an analysis based on Surveillance, Epidemiology, and End Results 1973–1991. J Neurosurg 88:1–10, 1998 [3] Deen DF et al: Brain Tumor Working Group Report on the 9th International Conference on Brain Tumor Research and Therapy. Organ System Program, National Cancer Institute. J Neurooncol 16:243–272, 1993  Plus fréquente tumeur primaire encéphalique [1]  Médiane de survie = mois si traitement maximum [2]  Taux de survie à 5 ans < 10% et mortalité finale ≈ 100% [3]

Glioblastome : Impasse thérapeutique Malgré des recherches importantes..

Bevacizumab/Avastin

 6/05/2009, FDA : Autorisation basée sur des études en phase II ! [4-5]  ↗ Médianes de survie par rapport aux données de bases nationales Bevacizumab/Avastin [4] Vredenburgh et al.Bevacizumab plus irinotecan in recurrent glioblastoma multiforme. J Clin Oncol 2007;25:4722 [5]Cloughesy et al. A phase II, randomized, non-comparative clinical trial of the effect of bevacizumab (BV) alone or in combination with irinotecan (CPT) on 6-month progression free survival in recurrent, treatment-refractory glioblastoma (GBM) J Clin Oncol 2008;26.

Problemes La résistance aux traitements anti-angiogéniques est la règle [6], sans doutes via des voies alternatives. Les gliomes traités par avastin adoptent un comportement plus invasif, à la fois chez la souris [7] et chez les patients [8]

VEGF : La cible du bévacizumab [2]  Protéine clé de l’angiogénèse  Action sur les cellules endothéliales ↗ Perméabilité ↗ Prolifération ↗ Migration ↗ Survie  Cancérogénèse: le switch angiogénique

Télomères et crise cellulaire Rôle des télomères Régions répétitives –TTAGGG des extrémités des chromosomes  Protection des chromosomes [4] Robert A. Weinberg, The biology of cancer 2006 Garland science ISBN : '...TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..3' 3'.AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC..5'

Télomères et crise cellulaire A chaque réplication, la longueur des télomères des cellules diminue. L’absence de télomère entraine la mort cellulaire par déstabilisation génomique, et donc la crise. [4] Robert A. Weinberg, The biology of cancer 2006 Garland science ISBN :

Maintenance de la longueur des télomères : télomérase  Effectuée par l’enzyme télomérase  Catalyse l’addition des répétitions télomériques aux extrémités des chromosomes  Exprimée uniquement dans les cellules germinales, les tissus embryonaires, les cellules souches.. et les cellules cancéreuses

Objectifs Constatation 1 : 80% des cancers présentent une forte activité télomérase Constatation 2 : Dans certains cancers sans activité télomérase des mécanismes alternatifs de maintenance des télomères ont été décrits (ALT = alternative lengthening mechanism) Constatations 3: l Les cellules des CMT présentent de faibles taux de télomérase.  Bien que faible, ce taux contribue-t-il au processus cancéreux ?

Comment les cellules issues de CMT se comportent-elles en culture ? Que se passe-t-il si on induit une forte activité télomérase dans ces cellules ? Que se passe-t-il si on bloque la (faible) activité télomérase dans ces cellules

8 lignées cellulaires issues de CMT mises en culture Ham’s F12 / M199 (1:1) + 4 mM/L-Glutamine et 10% w/v serum de veau foetal

TRAP assay [x] M. Meyerson et al. Cell (90) , 1997

Flow Fish pour la mesure des télomères Hybridation in situ + Cytométrie en flux [4] Nature Protocols 1, (2006)

TA faible sauf pour GSJO Télomères stables pour GSJO ↘ Télomères pour toutes les autres lignées

Comptage des cellules vivantes par marquage au bleu tryptan et haemocytometrie  Plateau de croissance  Nombre de doublements atteints variables selon la lignée Evolution des cultures

Avant le plateau  70% des cellules GRS-V se divisent activement  5% des cellules sont en apoptose Après le plateau  25% des cellules GRS-V se divisent activement  30% des cellules en apoptose précoce  30% des cellules en apoptose tardive Marquage Brdu et marquage annexinV-Iodure de propidium

Immortalisation spontanée Rares immortalisations spontanée par réactivation de la télomérase Niveau d’activité télomérase très variables Modifications du phénotype cellulaire associées

Analyse des niveau d’expression des mRNA de c-Myc par Reverse PCR temps réelle quantitative Immortalisation spontanée

Induction de l’expression ectopique de télomérase 1.Gène de résistance aux ATB 2.Site de clonage multiple positionné au sein d’un gène de sélection 3.Origine de réplication Coupure du plasmide et du fragment d’ADN d’intérêt avec la même enzyme de restriction. Si l’ADN s’est inséré dans le gène de sélection ce dernier ne s’exprime plus. Induction ectopique de la télomérase par méthode des plasmides recombinants

Evolution des cellules transfectées Immortalisation Pas de sur-expression de c-Myc Caryotype normal

Croissance en présence d’un inhibiteurs des télomérases MST-312 Non toxicité de MST-312 Culture vs contrôle sur 7 jours : dose maximale non toxique = 150nM Culture de la lignée MTC-SK spontanément immortalisée, avec ou sans MST-312

Croissance en présence d’un inhibiteurs des télomérases MST-312 Culture de la lignée MTC-SK Avec ou sans MST-312 ↘ nbr de PD atteints → Viablité comparable ↘ Vitesse de prolifération ↘ Longueur des télomères plus rapide dans les cellules traitée Longueur des télomères comparables au final

Discussion ❶ De manière générale, faible TA dans les CMT. → Conclusion des auteurs : la maintenance des télomères n’est pas nécessaire dans les CMT (voir critiques) ❷ Cette TA est néanmoins plus élevée que dans les cellules somatiques normales ❸ L’inhibition de la TA par MST-312 ↘ le nombre de PD atteint au moment de la crise.

Discussion En conclusion diminuer l’activité télomérase dans des tumeurs présentant une faible activité initiale pourrait permettre de limiter le nombre de divisions des cellules cancéreuses, et donc de diminuer le risque stochastique de mutations de-novo.

Discussion Possibilités thérapeutiques : il est alors légitime de tester à l’avenir d’éventuelles thérapies anti-télomérase sur les cancers médullaires de la thyroïde.

Critiques et discussion personnelle Sur 8 lignées cellulaires au départ, on fini par n’avoir les résultats que sur une (MTC-SK) MTC-SK est caractérisée dans d’autres articles, et notamment dans l’article qui a vu son isolation initiale, comme étant une lignée cellulaire continue (continuous cell line). Ici MTC-SK est mortelle. Quid ? La littérature confirme le lien hTERT et c-myc Les mécanismes ALT sont évoqués dans l’introduction mais passés sous silence après.

Critiques et discussion personnelle Concernant la thérapeutique anti-télomérase →Effets pervers à l’horizon ? →Cas des souris p53-/- et mTR-/- VS p53-/- seul

Deux phénomènes limitent la prolifération cellulaire Senescence  Les cellules humaines cultivées in-vitro finissent par entrer en sénescence au bout d’un temps dépendant des conditions de culture : Hayflick’s limit [4] Robert A. Weinberg, The biology of cancer 2006 Garland science ISBN :

Télomères et cancer Sénescence :  Les taux de p21 et p16 augmentent lorsque les cellules approchent de la sénescence, et d’autant plus rapidement que les conditions de cultures sont défavorables. [4] Robert A. Weinberg, The biology of cancer 2006 Garland science ISBN :

Télomères et cancer Crise :  L’inactivation des voies des voies liées à P16/P21 permet aux cellules de se multiplier au-delà de la sénescence.  Mais rapidement les cellules entrent en apoptose : La crise cellulaire. [5]