Amélioration des défenses de la vigne contre ses maladies - équipe « Résistance Dérivée du Pathogène » (RDP) C. Demuyter, S. Bruisson, J. Ocaña, L. Deglène-Benbrahim, C. Le Jeune, P. Maillot, P. Schellenbaum, L. Valat, B. Walter   Université de Haute Alsace, Laboratoire Vigne, Biotechnologies et Environnement, EA-3991, BP50568, 68008 Colmar cedex 2 programmes : I. Résistance Dérivée du Pathogène (RDP) contre le GFLV, agent du court-noué de la vigne II. Programme CLOVIS : « CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis, moins sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins

I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV Lutte contre le GFLV : concept de Résistance Dérivée du Pathogène Stratégie des microARNs artificiels Jelly 2011, d'après Antonio Garcia & Simon-Mateo 2008 2 axes Validation de la stratégie sur N. benthamiana Validation de la stratégie sur Vitis vinifera Constructions (Jelly, 2011) Positions des cibles des amiARNs sur les 2 ARNs génomiques du GFLV

I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV Axe 1 : Validation de la stratégie sur Nicotiana benthamiana - Expression de l’amiRNA vérifiée Détection des amiRNAs dans les lignées transgéniques de N. benthamiana (par sl-RT-PCR) - 21 lignées transgéniques obtenues - Insertion du transgène vérifiée Agro-infiltration de la cible pour vérifier la dégradation de la cible (Jelly, 2011) Inoculation mécanique du GFLV pour mettre en évidence l’inhibition de la réplication virale Efficacité lors de l’établissement de la maladie

I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera Transformation transitoire in vitro de la vigne  Infiltration de vitroplants (Syrah) avec Agrobacterium tumefaciens Valat L, Maillot P, Gadat M, Schellenbaum P, Jelly N S, Walter B (2013) 14° Rencontres de Virologie Végétales, 13-17 Janvier, Aussois, France.  Co-culture d’embryons (Chardonnay) avec Agrobacterium tumefaciens Culture produisant des embryons somatiques Isolement de 10-20 embryons somatiques dans une boîte de Pétri Dépôt d’une goutte de suspension d’agrobactéries sur chaque embryon Repiquage sur un milieu contenant des antibiotiques pour éliminer les agrobactéries Analyses moléculaires, 24h à 72h après Jelly N S, Schellenbaum P, Walter B, Maillot P (2012) Transgenic Research 21:1319-1327.  Analyses moléculaires - sl-RT-PCR - 5’RACE PCR - GUS-sensor Pour vérifier la dégradation de la cible

I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera Transformation stable de la vigne - Différentes lignées transgéniques obtenues Détection des amiRNAs exprimés dans 1 lignée transgénique de vigne (par sl-RT-PCR)  Analyses moléculaires - I-PCR, TAIL-PCR, RSE-PCR (insertion du transgène) - sl-RT-PCR (expression de l’amiRNA) - 5’RLM-RACE PCR (dégradation de la cible) (Jelly, 2011) Posters RVVS : Laure Valat, Pascale Maillot, Noémie S. Jelly, Paul Schellenbaum, Bernard Walter. Validation par expression transitoire dans la vigne d’amiRNAs dirigés contre le GFLV : tests GUS-sensor. Laurence Deglène-Benbrahim, Noémie Jelly, Paul Schellenbaum, Christine Le-Jeune, Bernard Walter, Pascale Maillot. Transformation stable de porte-greffes de vigne pour l’expression d’amiRNAs dirigés contre le GFLV.

II. Programme CLOVIS « CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis, moins sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins Projet (2010-2014) : - labellisé par le pôle de compétitivité VITAGORA (Dijon) soutenu par le Fonds Unique Interministériel & OSEO Consortium regroupant : Pépinières Viticoles Guillaume (Charcenne, 71) SEDIAG - Anticorps et Diagnostics (Dijon, 21) Association Technique Viticole de Bourgogne (ATVB, Beaune, 21) Equipe RDP du LVBE

II. Programme CLOVIS 3 objectifs d’innovation stratégique : - développer une méthode plus sensible de diagnostic des pathologies de la vigne - produire des plants assainis et moins sensibles aux pathogènes : mycorhizés et/ou producteurs de resvératrol accroître la diversité de l’offre accessible aux viticulteurs en développant et produisant de nouvelles vignes Deux axes de recherche – développement pour notre équipe Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir) Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne

II. Programme CLOVIS Origine de la diversité génétique chez la vigne : Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir) Origine de la diversité génétique chez la vigne : - altérations génétiques (changements dans la séquence d’ADN) - altérations épigénétiques (variations non codées par la séquence d’ADN modifiant l’expression des gènes) Clone 1 AACCAGTAACCAGT-------AATGCTGCCGGATGC Clone 2 AACTAGTAACCAGTGATCGATAATGCTGCCGGATGC SNP Insertion/Délétion Méthylation (C) Me But : étude de la variabilité génétique et épigénétique de clones de Pinot Noir - évaluer la diversité de clones (marqueurs moléculaires « neutres ») - définir des technique(s) fiable(s) et informative(s) pour visualiser les variations et permettant la distinction clonale (« technique de routine »)

II. Programme CLOVIS Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir) Technique de marquage moléculaire : MSAP : Methylation Sensitive Amplified Polymorphism (Etude réalisée sur 40 clones, agréés et nouvelles obtentions) Résultats - Présence de bandes polymorphes stables et instables - 9 combinaisons d’amorces; 23 marqueurs polymorphes stables - 38 profils distincts (37 uniques et 1 partagé par 3 clones) distinction épigénétique des clones Ocaña et al, 2013, Molecular Biotechnology, DOI 10.1007/s12033-013-9675-3

II. Programme CLOVIS Symbioses mycorhiziennes arbusculaires But : Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne Symbioses mycorhiziennes arbusculaires - tolérance aux stress biotiques et abiotiques Champignon mycorhizogène à arbuscules dans un système racinaire But : => Produire des plants de vigne mycorhizés moins sensibles aux pathogènes Etudes réalisées : - contrôle de l’installation de la mycorhization - analyse de l’expression de gènes marqueurs de défense * après élicitation * suite à l’inoculation de pathogènes - mesure de l’évolution des teneurs en stilbènes Suivi de la mycorhization : Inoplant Dijon

II. Programme CLOVIS Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne Recherche de gènes potentialisés par la mycorhization (marqueurs de « priming ») - Éliciteurs chimiques (voie SA et voie JA/ETH) - Infection par des micro-organismes pathogènes (biotrophes et nécrotrophes) - Analyse de l’expression de gènes de défense par qPCR Expression de gènes de défense dans des feuilles de plants de Pinot Noir mycorhizés ou non, traités avec du Bion®

II. Programme CLOVIS Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne Etude de l’expression de gènes marqueurs de défense Persistance du « priming » dans le temps Suivi du taux de mycorhization Maintien du priming de gènes de défense Etude de l’effet protecteur des mycorhizes vis-à-vis de bioagresseurs - Infection par Plasmopara viticola et Botrytis cinerea Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. Journées francophones des mycorhizes 2012, 5-7 sept, Nancy, France. Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. 1st world congress on the use of biostimulants in agriculture, 26-29 nov, Strasbourg, France. Feuille de Pinot Noir infectée par Botrytis cinerea

II. Programme CLOVIS Poster RVVS Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir) Juan Ocaña, Bernard Walter, Paul Schellenbaum. Distinction of Vitis vinifera cv Pinot noir clones by stable MSAP markers. Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Deglène-Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter. Effet de la mycorhization sur l’expression des gènes de défense de la vigne après élicitation chimique ou inoculation de pathogènes.