PCR en temps réel (PCR quantitative)

But Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle Comprendre les calculs de base pour la quantification avec la PCR en temps réel Comprendre les differences entre la PCR en temps réel et le transfert Northern

Applications de la PCR en temps réel Méthode quantitative puissante Expression génique Détermination/suivi de la charge virale Quantification de gènes cancerigène Vérification de biopuce Vérification de transgène Analyses de SNP

Étapes de la PCR en temps réel Trois phases Plateau Quantité de produit de PCR Phase linéaire Phase exponentielle Nombre de cycles

Amplification exponentielle Xn = X0 * (1 + E) n E = [10(–1/pente)] – 1 (Efficacité = 1 dans la phase exponentielle) Xn = Copies d’ADN au cycle n X0 = Copies d’ADN au cycle 0 E = Efficacité d’amplification n = Nombre de cycles

Système de détection quantitatif Détection de la fluorescence Deux types de fluorochromes Ceux qui se lient à l’ADN double brin Sondes à ADN avec fluorochrome

SYBR green (Lie l’ADN double brin) Plus commun

Sondes avec fluorochromes (FAM, VIC, TET, FRET) Moins commun Fluorochrome Atténuateur

SYBR green Vs. Sondes avec fluoro. Ne discrimine entre le gène d’interêt et d’autres ADN (e.g. contamination) Ne permet pas la PCR multiplex Moins d’étapes requises Moins coûteux Discrimine, plus spécifique Permet la PCR multiplex avec usage of different fluoro. Requiert moins d’étapes Plux coûteux

Zones de détection PCR en temps réel vs PCR trad. PCR traditionnelle EtBr Quantité de produit de PCR Nombre de cycles PCR en temps réel

Quantification de l’amplicon de PCR en temps réel Augmentation de la fluorescence est proportionnelle à l’amplification d’ADN Le premier cycle auquel l’instrument peut déterminer l’augmentation de fluorescence comme étant au dessus du bruit de fond est le cycle seuil “Ct” (threshold cycle)

Le cycle seuil (Ct) Exemple de Ct Ct

Le cycle seuil (Ct) Ct de trois différents échantillons

Le cycle seuil (Ct) Le Ct est inversement proportionnel à la concentration initiale d’un échantillon e.g. Plus la concentration d’ADN est grande plus la valeur du Ct est petite

Méthodes quantitatives Quantification absolue Pour déterminer la quantité exacte d’ADN (e.g. charge virale) Quantification relative Pour déterminer le changement d’expression génique

Quantification absolue Si la quantité initiale d’DNA est connue: XT = X0 * (1 + E) Ct Si non, les Ct des échantillons doivent être comparés à ceux d’une courbe d’étalon XT = quantité d’ADN au cycle seuil X0 = quantité d’ADN au cycle 0 E = efficacité d’amplification Ct = cycle seuil

Quantification absolue Echantillon du gène Mel1 dont le Ct après amplification est 22.5 cycles. Quelle est la concentration de l’amplicon?

Quantification absolue Concentration de l’amplicon de Mel1 Ct de 22.5 y = -3.1392 x + 18.221 22.5 = -3.1392 x + 18.221 x = -1.3630 10 -1.3630 (Log inverse de 10) La concentration d’ADN est 0.043 µg/ml

Quantification relative Normaliser le gène d’interêt à un gène domestique Échantillon Gène domestique Rapport =

PCR en temps réel Vs. Transfert northern Plus sensible (besoin ~50 ng d’ADN) Plus précis (peut déterminer no copies) Matrice d’ADN (stable) Ne donne pas la taille des transcrits Plus rapide (juste quelques heures) Moins d’étapes impliquées Moins sensible (besoin de ~10 ug d’ADN) Moins précis (ne peut pas déterminer no copies) Matrice d’ARN (instable) Donne la taille des transcrits Long (Plusieurs heures à jours) Beaucoup d’étapes impliquées