Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae Melissa PETITI M2 MBVB Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-hôtes Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae

Vibrio cholerae Bactérie gram – 1 flagelle polaire Introduction Vibrio cholerae Bactérie gram – 1 flagelle polaire Sécrétion de la toxine cholérique Figure 1 : V. cholerae observées au microscope électronique

Le système de sécrétion de type 2 Introduction Le système de sécrétion de type 2 Prise en charge des protéines après translocation dans le périplasme via Sec/Tat Complexe inséré dans les deux membranes Analogie avec le Pilus de type IV Figure 2 : Modèle de sécrétion des protéines via le SST2 Chez P. aeruginosa (Voulhoux et al. 2001)

Modèle du SST2 chez V. cholerae Introduction Modèle du SST2 chez V. cholerae Complexe protéique codé par les gènes eps EpsD : sécrétine EpsE : ATPase de trafic EpsG : pseudopilus ( + Eps HIJK ) EpsM, L, C et F : plateforme de membrane interne Figure 3 : Modèle du SST2 chez V. cholerae

2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire Partie 1 2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire Figure 4 : Localisation des protéines de fusion pGFP-EpsL et pGFP-EpsM (Scott et al. 2001) Localisation polaire n’est elle pas due a la surproduction de pEPsMGFP ? ( article 2006 Pulm non surproduite n’est pas aux pôles) Figure 5 : Microscopie à fluorescence en temps réel pour la protéine de fusion pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)

EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ? 1 : Localisation cellulaire de la protéine pGFP-EpsM EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ? Observer la localisation cellulaire des protéines codées par les gènes eps Fusion des protéines d’intérêt à la GFP Expression à partir d’un plasmide avec et sans induction dans une souche mutante

La distribution native d’EpsM n’est pas aux pôles cellulaires 1 : Localisation cellulaire De la protéine pGFP-EpsM La distribution native d’EpsM n’est pas aux pôles cellulaires Induction à l’IPTG : Foyers de fluorescence aux pôles de la cellules Sans induction : Fluorescence visible à la périphérie de la cellule Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine chimère pGFP-EpsM dans une souche mutante epsM

Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Partie 2 Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Observer la localisation cellulaire des protéines GFP-Eps produites à partir du chromosome copies chromosomiques des gènes eps remplacées par les copies fusionnées à la GFP (souches gfp-epsC et gfp-epsM) vérifier la production des protéines vérifier la fonctionnalité du système avec ces fusions

Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM GFP-EpsC GFP-EpsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM GFP-EpsC GFP-EpsM EpsC EpsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles Tableau 1 : Mesure de l’activité protéase des souches WT et possédant les fusions Mesure de l’activité des protéases sécrétées par V. cholerae via le SST2. Les protéines de fusion sont des composants fonctionnels du SST2

Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Le contexte d’expression a un réel effet sur la localisation intracellulaire des protéines chimères. Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes SST2 ? Partie 3 Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes SST2 ? Observer la co-expression des protéines natives et chimères. souche gfp-epsM + pEpsM souche gfp-epsC + pEpsC Construction de souches dans lesquelles l’opéron eps est sous le contrôle d’un promoteur inductible Introduction des fusions gfp-epsC et gfp-epsM sur le chromosome PBAD::eps gfp-epsC PBAD:: eps gfp-epsM

3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Les protéines natives ont remplacé les protéines chimères dans le complexe A B Figure 9 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM dans des souches contenant respectivement les plasmides pEpsC et pEpsM Signal GFP diffus dans les cellules Absence de foyers distincts de fluorescence

3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Le nombre de foyers et le taux de sécrétion augmentent avec le niveau d’expression x7 Figure 10 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM avec ou sans induction du promoteur pBAD Figure 11 : quantification des foyers de fluorescence et mesure de l’activité protéase correspondante

3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Les modèles précédents sont-ils fidèles à la distribution WT des protéines Eps Localisation du complexe SST2 par immunofluorescence Anticorps anti-EpsC Anticorps anti-EpsG

EpsG est distribuée à la périphérie des cellules 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? EpsG est distribuée à la périphérie des cellules WT WT ΔepsG ΔepsG Figure 12 : Localisation de la protéine EpsG native par immunofluorescence dans une souche WT et une souche ΔepsG

Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Partie 4 Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Relation entre le cytosquelette bactérien et le SST2 inhibition des filaments MreB et observer l’effet sur le SST2 Rôle d’ancrage, d’arrimage du complexe ? Mutations des gènes eps dans les souches gfp-epsC et gfp-epsM observer l’effet de ces mutations sur la sécrétion des protéines observer l’effet de ces mutations sur la localisation des protéines chimères

MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule Figure 13 : Localisation cellulaire de MreB (Jones et al. 2001)

Le SST2 s’assemble indépendamment des filaments MreB 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Le SST2 s’assemble indépendamment des filaments MreB ExtB Figure 15 : Effet du A22 sur le niveau de sécrétion Figure 14 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC et croissance bactérienne après traitement de la souche gfp-epsC au A22

Les mutations affectent la fonction du complexe SST 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les mutations affectent la fonction du complexe SST L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 2 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées

Les mutations affectent la fonction du complexe SST 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les mutations affectent la fonction du complexe SST L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 3 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées

EpsD est requise pour un assemblage focal d’EpsC 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsD est requise pour un assemblage focal d’EpsC ΔepsD : fluorescence diffuse Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps

EpsM et EpsL stabilisent EpsC à la périphérie de la cellule 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM et EpsL stabilisent EpsC à la périphérie de la cellule ΔepsM ou ΔepsL : fluorescence aux pôles en phase stationnaire Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps

EpsM requière EpsC pour sa localisation 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM requière EpsC pour sa localisation ΔepsC : fluorescence diffuse Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

EpsM requière EpsD et EpsC pour sa localisation 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM requière EpsD et EpsC pour sa localisation ΔepsD : fluorescence diffuse Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte d’EpsM 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte d’EpsM Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées 11% de foyers jaunes : complexes SST2 assemblés. Foyers verts ou rouges : complexes dont l’assemblage n’est pas terminé. Figure 17 : Colocalisation des protéines GFP-EpsM et mCherry-EpsC dans une souche WT de V. cholerae

Enfin un premier modèle d’assemblage du SST2 ! Conclusion Enfin un premier modèle d’assemblage du SST2 ! 2009 : Première publication au sujet de l’assemblage du SST2 Localisation membranaire latérale Importance de la stœchiométrie entre les partenaires Mise en évidence d’un modèle d’assemblage

Conclusion Modèle d’assemblage EpsD semble être l’initiateur de la formation du complexe EpsC s’associe pour former un complexe mais interaction directe ? EpsL et EpsM s’assembleraient ensuite et EpsM stabiliserait cette interaction

Conclusion Pour aller plus loin Étude des interactions protéine/protéine physique (co-IP, double hybride) Etude interactions protéine/protéine par fluo (dynamique)

Merci de votre attention !